Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Thermophiles minangka mikroorganisme sing berkembang ing suhu dhuwur. Sinau bisa menehi informasi sing migunani babagan cara urip adaptasi karo kahanan sing ekstrim. Nanging, angel kanggo nggayuh kondisi suhu dhuwur kanthi mikroskop optik konvensional. Sawetara solusi sing digawe ing omah adhedhasar pemanasan listrik resistif lokal wis diusulake, nanging ora ana solusi komersial sing prasaja. Ing makalah iki, kita ngenalake konsep pemanasan laser microscale ing lapangan mikroskop kanggo nyedhiyakake suhu sing dhuwur kanggo pasinaon thermophile nalika njaga lingkungan sing entheng. Pemanasan skala mikro kanthi intensitas laser moderat bisa digayuh kanthi nggunakake substrat dilapisi nanopartikel emas minangka penyerap cahya sing biokompatibel lan efisien. Efek sing bisa ditindakake saka konveksi cairan skala mikro, retensi sel, lan gerakan thermophoretic centrifugal dibahas. Cara kasebut wis dituduhake ing rong spesies: (i) Geobacillus stearothermophilus, bakteri termofilik aktif sing ngasilake kira-kira 65 ° C, sing wis diamati tuwuh, tuwuh lan nglangi ing pemanasan skala mikro; (ii) Thiobacillus sp., archaea hipertermofilik optimal. ing 80 ° C. Karya iki mbukak dalan kanggo pengamatan mikroorganisme termofilik sing gampang lan aman nggunakake alat mikroskop modern lan terjangkau.
Liwat milyaran taun, urip ing Bumi wis berkembang kanggo adaptasi karo macem-macem kahanan lingkungan sing kadhangkala dianggep ekstrim saka perspektif manungsa. Utamane, sawetara mikroorganisme termofilik (bakteri, archaea, jamur) sing diarani thermophiles berkembang ing kisaran suhu saka 45 ° C nganti 122 ° C1, 2, 3, 4. Thermophiles manggon ing macem-macem ekosistem, kayata ventilasi hidrotermal segara jero, sumber panas. utawa wilayah vulkanik. Panaliten kasebut wis narik kawigaten sajrone sawetara dekade kepungkur amarga paling ora ana rong sebab. Kaping pisanan, kita bisa sinau saka wong-wong mau, contone, carane thermophiles 5, 6, enzim 7, 8 lan membran 9 stabil ing suhu dhuwur, utawa carane thermophiles bisa nahan tingkat nemen saka radiation10. Kapindho, minangka basis kanggo akeh aplikasi bioteknologi penting1,11,12 kayata produksi bahan bakar13,14,15,16, sintesis kimia (dihidro, alkohol, metana, asam amino, lan sapiturute)17, biomining18 lan biokatalis termostabil7,11, 13. Utamane, reaksi berantai polimerase (PCR)19 sing saiki kondhang nglibatake enzim (Taq polymerase) sing diisolasi saka bakteri termofilik Thermus aquaticus, salah sawijining thermophiles pisanan sing ditemokake.
Nanging, sinau babagan thermophiles dudu tugas sing gampang lan ora bisa diimprovisasi ing laboratorium biologi. Utamane, thermophiles sing urip ora bisa diamati ing vitro nganggo mikroskop cahya standar, sanajan karo kamar pemanas sing kasedhiya kanggo komersial, biasane dirating kanggo suhu nganti 40°C. Wiwit taun 1990-an, mung sawetara klompok riset sing ngabdi marang introduksi sistem mikroskop suhu dhuwur (HTM). Ing taun 1994 Glukh et al. Kamar pemanasan / pendinginan disusun adhedhasar panggunaan sel Peltier sing ngontrol suhu kapiler persegi panjang sing ditutup kanggo njaga anaerobik 20 . Piranti kasebut bisa dipanasake nganti 100 °C kanthi kecepatan 2 °C/s, saéngga penulis bisa nyinaoni motilitas bakteri hyperthermophilic Thermotoga maritima21. Ing taun 1999 Horn et al. Piranti sing meh padha wis dikembangake, isih adhedhasar panggunaan kapiler sing digawe panas sing cocog kanggo mikroskop komersial kanggo nyinaoni divisi / sambungan sel. Sawise wektu sing suwe ora aktif, goleki HTM sing efektif diterusake ing 2012, utamane sing ana hubungane karo seri makalah dening grup Wirth sing nggunakake piranti sing diciptakake dening Horn et al. Limalas taun kepungkur, motilitas saka akeh archaea, kalebu hyperthermophiles, diteliti ing suhu nganti 100 ° C nggunakake kapiler sing digawe panas23,24. Padha uga ngowahi mikroskop asli kanggo entuk pemanasan sing luwih cepet (sawetara menit tinimbang 35 menit kanggo nggayuh suhu sing disetel) lan entuk gradien suhu linear luwih saka 2 cm ngliwati medium. Piranti mbentuk gradien suhu (TGFD) iki wis digunakake kanggo nyinaoni mobilitas akeh thermophiles ing gradien suhu ing jarak sing cocog sacara biologis 24, 25.
Pemanasan kapiler tertutup ora mung cara kanggo mirsani thermophiles urip. Ing 2012, Kuwabara et al. Kamar Pyrex sing nganggo krasan sing disegel nganggo adhesive tahan panas (Super X2; Cemedine, Jepang) digunakake. Sampel kasebut dilebokake ing piring pemanasan transparan sing kasedhiya kanthi komersial (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Jepang) sing bisa dadi panas nganti 110 ° C, nanging asline ora dimaksudake kanggo bioimaging. Penulis diamati divisi efisien bakteri termofilik anaerob (Thermosipho globiformans, wektu dobel 24 menit) ing 65 ° C. Ing 2020, Pulshen et al. Pemanasan efisien saka piring logam komersial (AttofluorTM, Thermofisher) dituduhake nggunakake rong unsur pemanasan krasan: tutup lan panggung (konfigurasi sing diilhami mesin PCR). Asosiasi iki nyebabake suhu cairan seragam lan nyegah penguapan lan kondensasi ing ngisor tutup. Panggunaan O-ring ngindhari pertukaran gas karo lingkungan. HTM iki, disebut Sulfoscope, digunakake kanggo gambar Sulfolobus acidocaldarius ing 75°C27.
Watesan sing diakoni kanggo kabeh sistem iki yaiku watesan kanggo nggunakake tujuan udara, sembarang kecemplung lenga ora cocog kanggo suhu sing dhuwur lan kanggo pencitraan liwat conto transparan sing kandel> 1 mm. Watesan sing diakoni kanggo kabeh sistem iki yaiku watesan kanggo nggunakake tujuan udara, sembarang kecemplung lenga ora cocog kanggo suhu sing dhuwur lan kanggo pencitraan liwat conto transparan sing kandel> 1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, посколюмбужов ение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщ1инмой. Kekurangan sing diakoni saka kabeh sistem kasebut yaiku watesan kanggo nggunakake tujuan udara, amarga kecemplung lenga ora cocog kanggo suhu sing dhuwur lan kanggo visualisasi liwat conto transparan> 1 mm tebal.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的这合这样厚的透明样品成像. Watesan sing diakoni kanggo kabeh sistem iki yaiku watesan nggunakake pangilon sing duwe udara, amarga kecemplung lenga ora cocog kanggo nggambar conto transparan sing kandel> 1 mm ing suhu sing dhuwur. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, люмур масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Kelemahane sing diakoni saka kabeh sistem iki yaiku panggunaan lensa udara sing winates, kecemplung lenga apa wae ora cocog kanggo suhu sing dhuwur lan visualisasi liwat conto transparan sing kandel> 1 mm.Paling anyar, watesan iki diangkat dening Charles-Orzag et al. 28, sing ngembangake piranti sing ora ana maneh nyedhiyakake panas ing saindhenging sistem kapentingan, nanging ing jero kaca tutup dhewe, ditutupi karo lapisan transparan tipis saka resistor sing digawe saka ITO (indium-tin oxide). Tutup bisa digawe panas nganti 75 ° C kanthi ngliwati arus listrik liwat lapisan transparan. Nanging, penulis uga kudu panas lensa kanggo obyektif, nanging ora luwih saka 65 °C, supaya ora ngrusak.
Karya-karya kasebut nuduhake yen pangembangan mikroskop optik suhu dhuwur sing efisien durung diadopsi sacara luas, asring mbutuhake peralatan krasan, lan asring digayuh kanthi biaya resolusi spasial, sing minangka kerugian serius amarga mikroorganisme termofilik ora luwih gedhe tinimbang sawetara. mikrometer. Ngurangi volume pemanasan minangka kunci kanggo ngrampungake telung masalah HTM sing ana: resolusi spasial sing kurang, inersia termal sing dhuwur nalika sistem dadi panas, lan pemanasan sing mbebayani saka unsur-unsur ing saubengé (lenga kecemplung, lensa objektif ... utawa tangan pangguna) ing suhu sing ekstrem. ).
Ing makalah iki, kita ngenalake HTM kanggo pengamatan thermophile sing ora adhedhasar pemanasan resistif. Nanging, kita entuk pemanasan lokal ing wilayah sing winates ing bidang mikroskop kanthi iradiasi laser saka substrat sing nyerep cahya. Distribusi suhu divisualisasikan menggunakan mikroskop fase kuantitatif (QPM). Efektivitas metode iki dibuktekake dening Geobacillus stearothermophilus, bakteri termofilik motil sing reproduksi kira-kira 65 ° C lan duwe wektu tikel kaping pindho (udakara 20 menit), lan Sulfolobus shibatae, hyperthermophile sing tuwuh kanthi optimal ing suhu 80 ° C (archaea). kanggo ilustrasi. Tingkat replikasi normal lan nglangi diamati minangka fungsi saka suhu. Laser HTM (LA-HTM) iki ora diwatesi dening kekandelan coverslip utawa sifat obyektif (udhara utawa lenga kecemplung). Iki ngidini sembarang lensa resolusi dhuwur ing pasar bisa digunakake. Uga ora nandhang panas alon amarga inersia termal (nggayuh pemanasan cepet ing skala milidetik) lan mung nggunakake komponen sing kasedhiya kanthi komersial. Siji-sijine masalah safety anyar yaiku anané sinar laser sing kuat (biasane nganti 100 mW) ing njero piranti lan bisa uga liwat mripat, sing mbutuhake kaca tingal protèktif.
Prinsip LA-HTM yaiku nggunakake laser kanggo panas sampel lokal ing lapangan tampilan mikroskop (Fig. 1a). Kanggo nindakake iki, sampel kudu nyerep cahya. Kanggo nggunakake daya laser cukup (kurang saka 100 mW), kita ora gumantung ing panyerepan cahya dening medium Cairan, nanging artificially nambah panyerepan saka sampel dening nutupi substrat karo nanopartikel emas (Fig. 1c). Pemanasan nanopartikel emas kanthi cahya penting banget kanggo bidang plasmonik termal, kanthi aplikasi sing dikarepake ing biomedis, nanokimia utawa panen sinar matahari29,30,31. Sajrone sawetara taun kepungkur, kita wis nggunakake LA-HTM iki ing sawetara studi sing ana gandhengane karo aplikasi plasma termal ing fisika, kimia lan biologi. Kangelan utama karo cara iki kanggo nampilake profil suhu pungkasan, amarga suhu munggah pangkat diwatesi kanggo wilayah microscale ing sampel. Kita wis nuduhake yen pemetaan suhu bisa digayuh kanthi interferometer geser transversal papat gelombang, cara mikroskop fase kuantitatif sing prasaja, resolusi dhuwur, lan sensitif banget adhedhasar panggunaan grating difraksi rong dimensi (uga dikenal minangka kisi silang). 33,34,35,36. Keandalan teknik mikroskop termal iki, adhedhasar crossed grating wavefront microscopy (CGM), wis dituduhake ing rolas makalah sing diterbitake sajrone dekade kepungkur37,38,39,40,41,42,43.
Skema instalasi pemanasan laser paralel, mbentuk lan mikroskop suhu. b Sample geometri kasusun saka kamar AttofluorTM ngemot coverslip dilapisi nanopartikel emas. c Deleng kanthi teliti ing sampel (ora kanggo skala). d nggambarake profil sinar laser seragam lan (e) simulasi distribusi suhu sakteruse ing bidang sampel nanopartikel emas. f punika profil sinar laser annular cocok kanggo ngasilaken suhu seragam minangka ditampilake ing simulasi saka distribusi suhu asil ditampilake ing (g). Skala bar: 30 µm.
Utamane, kita bubar entuk pemanasan sel mamalia kanthi LA-HTM lan CGM lan nglacak respon kejut panas seluler ing kisaran 37-42 ° C, nuduhake aplikasi teknik iki kanggo pencitraan sel urip tunggal. Nanging, aplikasi LA-HTM kanggo nyinaoni mikroorganisme ing suhu dhuwur ora jelas, amarga mbutuhake luwih ati-ati dibandhingake karo sel mamalia: pisanan, pemanasan dhasar medium kanthi puluhan derajat (tinimbang sawetara derajat) ndadékaké. menyang gradien suhu vertikal kuwat. bisa nggawe konveksi cairan 44 sing, yen ora ditempelake kanthi kuat ing substrat, bisa nyebabake gerakan sing ora dikarepake lan campuran bakteri. Konveksi iki bisa diilangi kanthi ngurangi kekandelan lapisan cair. Kanggo tujuan iki, ing kabeh eksperimen sing ditampilake ing ngisor iki, suspensi bakteri diselehake ing antarane rong tutup tutup sing kira-kira 15 µm kandel diselehake ing jero cangkir logam (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Ing asas, konveksi bisa nyingkiri yen kekandelan saka Cairan luwih cilik saka ukuran beam saka laser dadi panas. Kapindho, nggarap geometri sing winates bisa nyedhot organisme aerobik (pirsani Gambar S2). Masalah iki bisa dihindari kanthi nggunakake substrat sing permeabel kanggo oksigen (utawa gas penting liyane), kanthi ninggalake gelembung udara sing kepepet ing tutup tutup, utawa ngebor bolongan ing tutup tutup ndhuwur (pirsani Gambar S1) 45 . Ing panliten iki, kita milih solusi sing terakhir (Gambar 1b lan S1). Pungkasan, pemanasan laser ora nyedhiyakake distribusi suhu sing seragam. Malah ing intensitas sinar laser sing padha (Gambar 1d), distribusi suhu ora seragam, nanging meh padha karo distribusi Gaussian amarga difusi termal (Gambar 1e). Nalika tujuane kanggo netepake suhu sing tepat ing bidang tampilan kanggo sinau sistem biologi, profil sing ora rata ora becik lan uga bisa nyebabake gerakan thermophoretic bakteri yen ora netepi substrate (pirsani Gambar S3, S4)39. Kanggo tujuan iki, kita nggunakake modulator cahya spasial (SLM) kanggo mbentuk sinar laser infra merah miturut wangun dering (Fig. 1f) ing bidang sampel kanggo entuk distribusi suhu sing seragam ing area geometris tartamtu. senadyan difusi termal (Fig. 1d) 39, 42, 46. Selehake coverslip ndhuwur liwat sajian logam (Figure 1b) supaya penguapan saka medium lan mirsani kanggo ing paling sawetara dina. Amarga tutup tutup ndhuwur iki ora disegel, medium tambahan bisa gampang ditambahake kapan wae yen perlu.
Kanggo nggambarake cara kerja LA-HTM lan nduduhake ditrapake ing riset termofilik, kita nyinaoni bakteri aerobik Geobacillus stearothermophilus, sing nduweni suhu pertumbuhan paling optimal sekitar 60-65°C. Bakteri uga nduweni flagella lan kemampuan kanggo nglangi, nyedhiyakake indikator liyane aktivitas seluler normal.
Sampel (Gambar 1b) wis diinkubasi sadurunge ing 60 ° C sajrone jam siji lan banjur diselehake ing wadhah sampel LA-HTM. Pre-inkubasi iki opsional, nanging isih migunani, amarga rong alasan: Kaping pisanan, nalika laser diuripake, nyebabake sel langsung tuwuh lan dibagi (pirsani film M1 ing Bahan Tambahan). Tanpa pra-inkubasi, pertumbuhan bakteri biasane telat kira-kira 40 menit saben area tampilan anyar digawe panas ing sampel. Kapindho, 1 jam pra-inkubasi dipun promosiaken adhesion saka bakteri menyang coverslip, nyegah sel saka drifting metu saka lapangan tampilan amarga thermophoresis nalika laser diuripake (ndeleng film M2 ing Bahan Tambahan). Thermophoresis yaiku obahe partikel utawa molekul ing sadawane gradien suhu, biasane saka panas nganti adhem, lan bakteri ora kajaba43,47. Efek sing ora dikarepake iki diilangi liwat area tartamtu kanthi nggunakake SLM kanggo mbentuk sinar laser lan entuk distribusi suhu sing rata.
Ing anjir. Figure 2 nuduhake distribusi suhu diukur dening CGM dijupuk dening irradiating substrat kaca ditutupi karo nanopartikel emas karo sinar laser annular (Fig. 1f). Distribusi suhu rata diamati ing kabeh wilayah sing ditutupi sinar laser. Zona iki disetel dadi 65 ° C, suhu pertumbuhan optimal. Ing njaba wilayah iki, kurva suhu alamiah mudhun menyang \(1/r\) (ngendi \(r\) minangka koordinat radial).
peta Suhu pangukuran CGM sing dipikolehi kanthi nggunakake sinar laser annular kanggo iradiasi lapisan nanopartikel emas kanggo entuk profil suhu sing rata ing area bunder. b Isoterm saka peta suhu (a). Kontur sinar laser diwakili dening bunder burik abu-abu. Eksperimen kasebut diulang kaping pindho (pirsani Bahan Tambahan, Gambar S4).
Viabilitas sel bakteri dipantau nganti pirang-pirang jam nggunakake LA-HTM. Ing anjir. 3 nuduhake interval wektu kanggo papat gambar sing dijupuk saka film 3 jam 20 menit (Film M3, Informasi Tambahan). Bakteri diamati aktif proliferasi ing area bunder sing ditemtokake dening laser ing ngendi suhu optimal, nyedhak 65 ° C. Ing kontras, wutah sel suda sacara signifikan nalika suhu mudhun ing ngisor 50 ° C sajrone 10 detik.
Gambar ambane optik bakteri G. stearothermophilus sing tuwuh sawise pemanasan laser ing wektu sing beda-beda, (a) t = 0 menit, (b) 1 jam 10 menit, (c) 2 jam 20 menit, (d) 3 jam 20 menit, metu saka 200 Diekstrak saka film siji menit (film M3 sing kasedhiya ing Informasi Tambahan) sing ditumpangake ing peta suhu sing cocog. Laser urip ing wektu \(t=0\). Isotherms wis ditambahake menyang gambar intensitas.
Kanggo luwih ngetung wutah sel lan katergantungan ing suhu, kita ngukur Tambah ing biomas saka macem-macem koloni bakteri pisanan diisolasi ing lapangan Movie M3 tampilan (Fig. 4). Bakteri induk sing dipilih nalika wiwitan pembentukan unit pembentuk koloni mini (mCFU) ditampilake ing Gambar S6. Pangukuran massa garing dijupuk nganggo kamera CGM 48 sing digunakake kanggo peta distribusi suhu. Kemampuan CGM kanggo ngukur bobot garing lan suhu yaiku kekuatan LA-HTM. Kaya sing dikarepake, suhu dhuwur nyebabake pertumbuhan bakteri luwih cepet (Gambar 4a). Kaya sing dituduhake ing plot semi-log ing Fig. 4b, wutah ing kabeh suhu ngetutake wutah eksponensial, ing ngendi data nggunakake fungsi eksponensial \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), ing ngendi \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}}2\) – wektu generasi (utawa wektu tikel), \(g =1/ \tau\) – tingkat wutah (jumlah divisi saben unit wektu). Ing anjir. 4c nuduhake tingkat wutah lan wektu generasi pamilike minangka fungsi saka suhu. MCFUs sing tuwuh kanthi cepet ditondoi kanthi jenuh wutah sawise rong jam, prilaku sing dikarepake amarga kapadhetan bakteri sing dhuwur (padha karo fase stasioner ing budaya cair klasik). Wangun umum \ (g \ kiwa (T \ tengen) \) (Fig. 4c) cocog karo kurva loro-phase samesthine kanggo G. stearothermophilus karo tingkat wutah optimal watara 60-65 ° C. Cocokake data nggunakake model kardinal (Gambar S5)49 ing ngendi \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\maks}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, sing cocog karo nilai-nilai liya sing dikutip ing literatur49. Senajan paramèter gumantung suhu bisa dibalèkaké, tingkat wutah maksimum \({G}_{0}\) bisa beda-beda saka siji eksperimen liyane (ndeleng tokoh S7-S9 lan film M4). Beda karo paramèter pas suhu, sing kudu universal, tingkat pertumbuhan maksimal gumantung saka sifat medium (kasedhiya nutrisi, konsentrasi oksigen) ing geometri microscale sing diamati.
wutah mikroba ing macem-macem suhu. mCFU: Unit Pembentuk Koloni Miniatur. Data dipikolehi saka video saka bakteri siji sing tuwuh ing gradien suhu (film M3). b Padha karo (a), skala semi-logaritma. c Tingkat wutah\(\tau\) lan wektu generasi\(g\) diitung saka regresi linier (b). Bar kesalahan horisontal: sawetara suhu sing mCFUs ditambahi menyang lapangan tampilan nalika tuwuh. Bar kesalahan vertikal: kesalahan standar regresi linier.
Saliyane pertumbuhan normal, sawetara bakteri kadhangkala ngambang nalika pemanasan laser, sing minangka prilaku sing dikarepake kanggo bakteri kanthi flagella. Film M5 ing informasi tambahan nuduhake aktivitas nglangi kuwi. Ing eksperimen iki, radiasi laser seragam digunakake kanggo nggawe gradien suhu, kaya sing ditampilake ing Gambar 1d, e lan S3. Gambar 5 nuduhake rong urutan gambar sing dipilih saka film M5 sing nuduhake yen siji bakteri nuduhake gerakan arah nalika kabeh bakteri liyane tetep ora obah.
Rong pigura wektu (a) lan (b) nuduhake nglangi rong bakteri beda sing ditandhani bunderan burik. Gambar dijupuk saka film M5 (kasedhiya minangka materi tambahan).
Ing kasus G. stearothermophilus, gerakan aktif bakteri (Gambar 5) diwiwiti sawetara detik sawise sinar laser diuripake. Observasi iki nandheske respon temporal saka mikroorganisme thermophilic iki kanggo Tambah ing suhu, minangka wis diamati dening Mora et al. 24 . Topik motilitas bakteri lan malah thermotaksis bisa luwih ditliti nggunakake LA-HTM.
Nglangi mikroba ora kena bingung karo jinis gerakan fisik liyane, yaiku (i) gerakan Brownian, sing katon minangka gerakan kacau tanpa arah sing jelas, (ii) konveksi 50 lan thermophoresis 43, sing dumadi saka gerakan reguler ing sadawane suhu. gradient.
G. stearothermophilus dikenal kanggo menehi kemampuan kanggo gawé spora Highly tahan (pembentukan spora) nalika kapapar kahanan lingkungan salabetipun minangka pertahanan. Nalika kondisi lingkungan dadi apik maneh, spora germinate, mbentuk sel urip lan nerusake wutah. Senajan proses sporulasi / germination iki wis dikenal, nanging ora tau diamati ing wektu nyata. Nggunakake LA-HTM, kita laporan kene pengamatan pisanan saka acara germination ing G. stearothermophilus.
Ing anjir. 6a nuduhake gambar wektu-kelewatan ambane optik (OT) dijupuk nggunakake pesawat CGM 13 spora. Kanggo kabeh wektu koleksi (15 h 6 min, \ (t = 0 \) - wiwitan pemanasan laser), 4 saka 13 spora germinated, ing titik wektu berturut-turut \ (t = 2 \) h, \( 3 \ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' lan \(11\) h \(30\)'. Sanajan mung siji saka acara kasebut ditampilake ing Gambar 6, 4 acara germination bisa diamati ing film M6 ing materi tambahan. Apike, germination katon acak: ora kabeh spora germinate lan ora germinate ing wektu sing padha, senadyan owah-owahan padha ing kahanan lingkungan.
a Time-lapse dumadi saka 8 gambar OT (kecemplung lenga, 60x, 1,25 NA obyektif) lan (b) evolusi biomassa G. stearothermophilus aggregates. c (b) Digambar ing skala semi-log kanggo nyorot linearitas tingkat wutah (garis putus-putus).
Ing anjir. 6b,c nuduhake biomas saka populasi sel ing lapangan tampilan minangka fungsi wektu liwat kabeh periode pangumpulan data. Bosok cepet saka massa garing diamati ing \(t=5\)h ing anjir. 6b, c, amarga metu saka sawetara sel saka lapangan tampilan. Tingkat wutah saka papat acara iki yaiku \(0.77\pm 0.1\) h-1. Nilai iki luwih dhuwur tinimbang tingkat wutah sing digandhengake karo Gambar 3. 3 lan 4, ing ngendi sel tuwuh kanthi normal. Alesan kanggo tambah tingkat wutah saka G. stearothermophilus saka spora ora cetha, nanging pangukuran iki nyorot kapentingan LA-HTM lan bisa ing tingkat sel siji (utawa ing tingkat mCFU siji) kanggo mangerteni sing luwih lengkap babagan dinamika urip sel. .
Kanggo luwih nduduhake versatility LA-HTM lan kinerja ing suhu dhuwur, kita mriksa wutah saka Sulfolobus shibatae, a hyperthermophilic acidophilic archaea karo suhu wutah optimal saka 80 ° C51. Dibandhingake karo G. stearothermophilus, archaea iki uga nduweni morfologi sing beda banget, meh padha karo 1 bola mikron (cocci) tinimbang batang sing elongated (bacilli).
Figure 7a kasusun saka gambar ambane optik urutan S. shibatae mCFU dijupuk nggunakake CGM (ndeleng film fitur M7 ing Bahan Tambahan). mCFU iki mundak akeh ing watara 73 ° C, ngisor suhu paling luweh saka 80 ° C, nanging ing sawetara suhu kanggo wutah aktif. Kita mirsani pirang-pirang acara fisi sing nggawe mCFU katon kaya micrograpes archaea sawise sawetara jam. Saka gambar OT iki, biomas mCFU diukur saka wektu lan ditampilake ing Gambar 7b. Apike, S. shibatae mCFUs nuduhake wutah linear tinimbang wutah eksponensial katon karo G. stearothermophilus mCFUs. Ana diskusi sing wis suwe 52 babagan sifat tingkat pertumbuhan sel: nalika sawetara studi nglaporake tingkat pertumbuhan mikroba sing sebanding karo ukurane (pertumbuhan eksponensial), liyane nuduhake tingkat konstan (linear utawa bilinear wutah). Kaya sing diterangake dening Tzur et al.53, mbedakake antarane pertumbuhan eksponensial lan (bi) linear mbutuhake presisi <6% ing pangukuran biomas, sing ora bisa digayuh kanggo akeh teknik QPM, malah nglibatake interferometri. Kaya sing diterangake dening Tzur et al.53, mbedakake antarane pertumbuhan eksponensial lan (bi) linear mbutuhake presisi <6% ing pangukuran biomas, sing ora bisa digayuh kanggo akeh teknik QPM, malah nglibatake interferometri. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измиостих для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Kaya sing diterangake dening Zur et al.53, mbedakake antarane eksponensial lan (bi) pertumbuhan linear mbutuhake akurasi <6% ing pangukuran biomas, sing ora bisa ditindakake kanggo umume metode QPM, sanajan nggunakake interferometri.Minangka diterangno dening Zur et al. 53, mbedakake antarane pertumbuhan eksponensial lan (bi) linear mbutuhake akurasi kurang saka 6% ing pangukuran biomas, sing ora bisa ditindakake kanggo umume metode QPM, sanajan interferometri digunakake. CGM entuk akurasi iki kanthi akurasi sub-pg ing pangukuran biomas36,48.
a Time-lapse dumadi saka 6 gambar OT (kecemplung lenga, 60x, NA obyektif 1.25) lan (b) micro-CFU biomass évolusi diukur karo CGM. Waca film M7 kanggo informasi luwih lengkap.
Wutah linear S. shibatae sing sampurna ora dikarepke lan durung dilaporake. Nanging, wutah eksponensial samesthine, paling ora amarga liwat wektu, sawetara divisi saka 2, 4, 8, 16 ... sel kudu kelakon. Kita hipotesis manawa wutah linier bisa uga amarga inhibisi sel amarga pambungkus sel sing padhet, kaya pertumbuhan sel saya mudhun lan pungkasane tekan kahanan dormant nalika kapadhetan sel dhuwur banget.
Kita rampungake kanthi ngrembug limang poin sing menarik ing ngisor iki: nyuda volume pemanasan, nyuda inersia termal, kapentingan ing nanopartikel emas, kapentingan ing mikroskop fase kuantitatif, lan sawetara suhu sing bisa digunakake ing LA-HTM.
Dibandhingake karo pemanasan resistif, pemanasan laser sing digunakake kanggo pangembangan HTM nawakake sawetara kaluwihan, sing digambarake ing panliten iki. Utamane, ing media cair ing bidang tampilan mikroskop, volume pemanasan disimpen ing sawetara (10 μm) 3 volume. Kanthi cara iki, mung mikroba sing diamati sing aktif, dene bakteri liyane ora aktif lan bisa digunakake kanggo sinau luwih lanjut sampel - ora perlu ngganti sampel saben wektu suhu anyar kudu dipriksa. Kajaba iku, pemanasan microscale ngidini ujian langsung saka sawetara gedhe saka Suhu: Figure 4c dijupuk saka film 3-jam (Movie M3), kang biasane mbutuhake preparation lan ujian sawetara conto - siji kanggo saben sampel diteliti. y yaiku suhu sing nuduhake jumlah dina ing eksperimen. Ngurangi volume sing digawe panas uga njaga kabeh komponen optik ing sekitar mikroskop, utamane lensa objektif, ing suhu kamar, sing dadi masalah utama sing diadhepi masyarakat nganti saiki. LA-HTM bisa digunakake karo lensa apa wae, kalebu lensa kecemplung minyak, lan bakal tetep ing suhu kamar sanajan kanthi suhu sing ekstrem ing bidang pandang. Watesan utama metode pemanasan laser sing dilapurake ing panliten iki yaiku sel sing ora manut utawa ngambang bisa uga adoh saka bidang pandang lan angel disinaoni. A workaround bisa nggunakake lensa nggedhekake kurang kanggo entuk munggah suhu luwih gedhe luwih saka sawetara atus microns. Ati-ati iki diiringi nyuda resolusi spasial, nanging yen tujuane kanggo nyinaoni gerakan mikroorganisme, resolusi spasial sing dhuwur ora dibutuhake.
Skala wektu kanggo dadi panas (lan pendinginan) sistem \({{{{{\rm{\tau}}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) gumantung saka ukurane , miturut hukum \({{{({\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), ngendi \ (L \ ) yaiku ukuran karakteristik sumber panas (diameter sinar laser ing panliten kita yaiku \ (L \ udakara 100 \) μm), \ (D \) yaiku diffusivity termal lingkungan (rata-rata ing kita kasus, kaca lan banyu Laju difusi\(D\ kira-kira 2\fold {10}^{-7}\) m2/s Mulane, ing panliten iki, respon wektu saka urutan 50 ms, yaiku kuasi-instan. owah-owahan suhu, bisa samesthine iki panyiapan cepet saka mundhak suhu ora mung shortens durasi saka eksperimen, nanging uga ngidini wektu pas \(t=0\) kanggo sembarang sinau dinamis saka efek suhu.
Cara sing diusulake bisa ditrapake kanggo substrat sing nyerep cahya (contone, conto komersial kanthi lapisan ITO). Nanging, nanopartikel emas bisa nyediakake panyerepan dhuwur ing inframerah lan panyerepan kurang ing sawetara katon, karakteristik pungkasan sing menarik kanggo pengamatan optik efektif ing sawetara katon, utamané nalika nggunakake fluoresensi. Kajaba iku, emas iku biokompatibel, kimia inert, Kapadhetan optik bisa diatur saka 530 nm kanggo near infrared, lan preparation sampel prasaja lan ekonomi29.
Transverse grating wavefront microscopy (CGM) ngidini ora mung pemetaan suhu ing microscale, nanging uga ngawasi biomassa, nggawe utamané migunani (yen ora perlu) ing kombinasi karo LA-HTM. Ing dekade kepungkur, teknik mikroskop suhu liyane wis dikembangake, utamane ing bidang bioimaging, lan umume mbutuhake probe fluoresensi sensitif suhu54,55. Nanging, cara kasebut wis dikritik lan sawetara laporan wis ngukur owah-owahan suhu sing ora nyata ing sel, bisa uga amarga kasunyatan manawa fluoresensi gumantung ing akeh faktor liyane saka suhu. Kajaba iku, paling probe neon ora stabil ing suhu dhuwur. Mulane, QPM lan khususe CGM minangka teknik mikroskop suhu sing cocog kanggo nyinaoni urip ing suhu dhuwur nggunakake mikroskop optik.
Studi babagan S. shibatae, sing urip kanthi optimal ing 80 ° C, nuduhake yen LA-HTM bisa diterapake kanggo sinau hipertermofil, ora mung thermophiles prasaja. Ing asas, ora ana watesan kanggo sawetara suhu sing bisa digayuh nggunakake LA-HTM, lan malah suhu ing ndhuwur 100 ° C bisa tekan ing tekanan atmosfer tanpa nggodhok, kaya sing dituduhake dening klompok kita 38 ing aplikasi kimia hidrotermal ing atmosfer. meksa A. A laser digunakake kanggo dadi panas nanopartikel emas 40 ing cara sing padha. Mangkono, LA-HTM duweni potensi kanggo digunakake kanggo mirsani hyperthermophiles unprecedented karo mikroskop optik resolusi dhuwur standar ing kahanan standar (ie ing kaku lingkungan).
Kabeh eksperimen ditindakake kanthi nggunakake mikroskop krasan, kalebu iluminasi Köhler (karo LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), wadhah spesimen kanthi gerakan xy manual, tujuan (Olympus, 60x, 0.7 NA, udara, LUCPlanFLN60X utawa 60x, 1.25 NA, Oil , UPLFLN60XOI), kamera CGM (QLSI cross grating, 39 µm pitch, 0,87 mm saka sensor kamera Andor Zyla) kanggo nyedhiyakake intensitas lan pencitraan wavefront, lan kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mode 16-bit, saka Hamamatsu) kanggo ngrekam data ditampilake ing Figure 5 (nglangi bakteri). Pemisah sinar dichroic yaiku pinggiran BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filter ing ngarep kamera punika 694 short pass Filter (FF02-694 / SP-25, Semrock). Laser safir titanium (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, rongga laser tsunami pompa, Spectra-Fisika ing Fig. 2-5, luwih diganti dening laser Millenia, Spectraphysics 10 W, dipompa rongga laser Mira, Koheren, kanggo Fig. 2 -5). 6 lan 7) disetel menyang dawa gelombang \({{{({\rm{\lambda }}}}}}}=800\) nm, sing cocog karo spektrum resonansi plasmon nanopartikel emas. Modulator cahya spasial (1920 × 1152 piksel) dituku saka Meadowlark Optik.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) minangka teknik mikroskop optik adhedhasar gabungan kisi difraksi rong dimensi (uga dikenal minangka cross grating) kanthi jarak siji milimeter saka sensor kamera konvensional. Conto sing paling umum saka CGM sing wis digunakake ing panliten iki diarani interferometer transversal transversal papat gelombang (QLSI), ing endi kisi silang kasusun saka pola checkerboard intensitas / fase sing dikenalake lan dipatenake dening Primot et al. ing 200034. Garis grating vertikal lan horisontal nggawe bayangan kothak-kaya ing sensor, distorsi kang bisa numerik diproses ing wektu nyata kanggo njupuk distorsi wavefront optik (utawa profil phase padha) saka cahya kedadean. Nalika digunakake ing mikroskop, kamera CGM bisa nampilake prabédan path optik saka obyek gambar, uga dikenal minangka ambane optik (OT), kanthi sensitivitas ing urutan nanometer36. Ing sembarang pangukuran CGM, kanggo ngilangi cacat ing komponen optik utawa balok, gambar OT referensi utama kudu dijupuk lan dikurangi saka gambar sakteruse.
Mikroskopi suhu ditindakake kanthi nggunakake kamera CGM kaya sing diterangake ing referensi. 32. Ing cendhak, panas Cairan ngganti indeks bias sawijining, nggawe efek lensa termal sing distorts balok kedadean. Distorsi wavefront iki diukur dening CGM lan diproses nggunakake algoritma deconvolution kanggo entuk distribusi suhu telung dimensi ing medium cair. Yen nanopartikel emas disebarake kanthi merata ing saindhenging sampel, pemetaan suhu bisa ditindakake ing wilayah sing bebas bakteri kanggo ngasilake gambar sing luwih apik, sing kadhangkala kita lakoni. Gambar CGM referensi angsal tanpa dadi panas (karo laser mati) lan salajengipun dijupuk ing lokasi sing padha ing gambar karo laser ing.
Pangukuran massa garing ditindakake kanthi nggunakake kamera CGM sing padha digunakake kanggo pencitraan suhu. Gambar referensi CGM dipikolehi kanthi cepet ngobahake sampel ing x lan y sajrone cahya minangka sarana rata-rata inhomogenitas ing OT amarga anane bakteri. Saka gambar bakteri OT, biomassa dijupuk nggunakake gamelan gambar ing wilayah sing dipilih nggunakake algoritma segmentasi krasan Matlab (pirsani bagean "Kode angka"), miturut prosedur sing diterangake ing ref. 48. Cekakipun, kita nggunakake relasi \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), ngendi \({{\mbox{OT}}}\kiwa(x,y\tengen)\) iku gambar ambane optik, \(m\) bobot garing lan \({{{{\rm{\alpha}}}}}}}\) iku konstanta. Kita milih \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, sing minangka konstanta khas kanggo sel urip.
Slip tutup kanthi diameter 25 mm lan kandel 150 µm sing dilapisi nanopartikel emas dilebokake ing ruang AttofluorTM (Thermofisher) kanthi nanopartikel emas madhep munggah. Geobacillus stearothermophilus dibudidayakake sewengi ing medium LB (200 rpm, 60 ° C) sadurunge saben dina eksperimen. Tetes 5 µl suspensi G. stearothermophilus kanthi kapadhetan optik (OD) 0,3 nganti 0,5 dilebokake ing slip tutup kanthi nanopartikel emas. Banjur, tutup tutup bunder kanthi diameter 18 mm kanthi bolongan diameter 5 mm ing tengah diturunake menyang tetes, lan 5 μl suspensi bakteri kanthi kapadhetan optik sing padha bola-bali ditrapake ing tengah bolongan. Sumur ing tutup tutup disiapake miturut prosedur sing diterangake ing ref. 45 (pirsani Informasi Tambahan kanggo informasi luwih lengkap). Banjur tambahake 1 ml medium LB menyang tutup tutup kanggo nyegah lapisan cair ora garing. Coverslip pungkasan diselehake ing tutup tutup saka kamar Attofluor™ kanggo nyegah penguapan medium sajrone inkubasi. Kanggo eksperimen germination, kita nggunakake spora, sing, sawise eksperimen konvensional, kadhangkala nutupi tutup tutup ndhuwur. Cara sing padha digunakake kanggo njupuk Sulfolobus shibatae. Telung dina (200 rpm, 75 ° C) budidaya awal Thiobacillus serrata ditindakake ing medium 182 (DSMZ).
Sampel nanopartikel emas disiapake kanthi litografi kopolimer blok micellar. Proses iki diterangake kanthi rinci ing Bab. 60. Sedhela, micelles encapsulating ion emas disintesis kanthi nyampur kopolimer karo HAuCl4 ing toluene. Tutup tutup sing wis diresiki banjur dicelupake ing larutan lan diobati nganggo iradiasi UV ing ngarsane agen pereduksi kanggo entuk wiji emas. Pungkasan, wiji emas ditanam kanthi ngubungi tutup tutup kanthi larutan KAuCl4 lan etanolamine sajrone 16 menit, sing ngasilake susunan nanopartikel emas non-sferis kanthi kuasi-periodik lan seragam ing infra merah cedhak.
Kanggo ngowahi interferograms menyang gambar OT, kita nggunakake algoritma krasan, minangka rinci ing link. 33 lan kasedhiya minangka paket Matlab ing gudang umum ing ngisor iki: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket kasebut bisa ngetung intensitas lan gambar OT adhedhasar interferogram sing direkam (kalebu gambar referensi) lan jarak array kamera.
Kanggo ngetung pola phase Applied kanggo SLM diwenehi profil suhu diwenehi, kita digunakake algoritma krasan sadurunge dikembangaké39,42 sing kasedhiya ing gudang umum ing ngisor iki: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Input minangka kolom suhu sing dikarepake, sing bisa disetel kanthi digital utawa liwat gambar bmp monokrom.
Kanggo bagean sel lan ngukur bobot garing, kita nggunakake algoritma Matlab sing diterbitake ing gudang umum ing ngisor iki: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Ing saben gambar, pangguna kudu ngeklik bakteri utawa mCFU sing disenengi, nyetel sensitivitas tongkat, lan konfirmasi pilihan.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain sinau, waca abstrak Laporan Riset Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.
Data sing ndhukung asil panaliten iki kasedhiya saka penulis sing ana ing panyuwunan sing cukup.
Kode sumber sing digunakake ing panliten iki rinci ing bagean Metode, lan versi debug bisa diundhuh saka https://github.com/baffou/ ing repositori ing ngisor iki: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, lan CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles and their wide-spectrum applications. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles and their wide-spectrum applications.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. lan Sharma, AK Ringkesan thermophiles lan aplikasi sudhut. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. lan Sharma AK Pangerten jero thermophiles lan sawetara saka sudhut aplikasi.3 Bioteknologi 6, 81 (2016).
Wektu kirim: Sep-26-2022