Penyakit Alzheimer (AD) ora duwe biomarker protein sing nggambarake macem-macem patofisiologi sing ndasari, ngalangi kemajuan diagnosis lan perawatan. Ing kene, kita nggunakake proteomik lengkap kanggo ngenali biomarker cairan cerebrospinal (CSF) sing makili macem-macem patofisiologi AD. Spektrometri massa multiplex diidentifikasi kira-kira 3.500 lan kira-kira 12.000 protein ing AD CSF lan otak, masing-masing. Analisis jaringan proteome otak ngrampungake 44 modul keanekaragaman hayati, 15 sing tumpang tindih karo proteome cairan cerebrospinal. Penanda CSF AD ing modul sing tumpang tindih iki dilipat dadi limang klompok protein, sing nuduhake proses patofisiologis sing beda. Sinapsis lan metabolit ing otak AD nyuda, nanging CSF mundhak, dene myelinasi lan gugus kekebalan sing sugih glial ing otak lan CSF mundhak. Konsistensi lan spesifik penyakit saka owah-owahan panel dikonfirmasi ing luwih saka 500 conto CSF tambahan. Klompok kasebut uga ngenali subkelompok biologis ing AD asimtomatik. Sakabèhé, asil kasebut minangka langkah sing njanjeni menyang alat biomarker basis web kanggo aplikasi klinis ing AD.
Penyakit Alzheimer (AD) minangka panyebab paling umum saka demensia neurodegeneratif ing saindenging jagad lan ditondoi kanthi macem-macem disfungsi sistem biologis, kalebu transmisi sinaptik, kekebalan glial-mediated, lan metabolisme mitokondria (1-3). Nanging, biomarker protein sing wis ditemtokake isih fokus kanggo ndeteksi protein amiloid lan tau, lan mulane ora bisa nggambarake patofisiologi sing maneka warna iki. Biomarker protein "inti" iki sing paling dipercaya diukur ing cairan serebrospinal (CSF) kalebu (i) amiloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), sing nggambarake pembentukan plak amyloid kortikal; (ii) total tau, tandha degenerasi akson; (iii) fosfo-tau (p-tau), wakil hiperfosforilasi tau patologis (4-7). Senajan biomarker cairan cerebrospinal iki wis banget nggampangake deteksi penyakit protein AD sing "ditandani" (4-7), mung minangka bagean cilik saka biologi kompleks sing ana ing mburi penyakit kasebut.
Kurang keragaman patofisiologi biomarker AD wis nyebabake akeh tantangan, kalebu (i) ora bisa ngenali lan ngitung heterogenitas biologis pasien AD, (ii) ukuran keruwetan lan kemajuan penyakit sing ora cukup, utamane ing tahap preclinical, Lan ( iii) pangembangan obat terapeutik sing gagal ngrampungake kabeh aspek kerusakan neurologis. Ketergantungan kita ing patologi landmark kanggo njlèntrèhaké AD saka penyakit sing gegandhengan mung nambah masalah kasebut. Bukti sing luwih akeh nuduhake yen umume wong tuwa sing duwe dimensia duwe luwih saka siji karakteristik patologis saka penurunan kognitif (8). Udakara 90% utawa luwih wong sing duwe patologi AD uga duwe penyakit pembuluh darah, inklusi TDP-43, utawa penyakit degeneratif liyane (9). Proporsi tumpang tindih patologis sing dhuwur iki wis ngganggu kerangka diagnostik kita saiki kanggo demensia, lan definisi patofisiologis sing luwih lengkap babagan penyakit kasebut dibutuhake.
Amarga kebutuhan mendesak kanggo macem-macem biomarker AD, lapangan kasebut tambah akeh nggunakake metode "omics" adhedhasar sistem sakabèhé kanggo nemokake biomarker. The Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance diluncurake ing 2014 lan ana ing ngarep program kasebut. Upaya multidisiplin iki dening Institut Kesehatan Nasional, akademisi, lan industri nduweni tujuan kanggo nggunakake strategi basis sistem kanggo luwih nemtokake patofisiologi AD lan ngembangake analisis diagnostik lan strategi perawatan biodiversity (10). Minangka bagéan saka proyek iki, proteomik jaringan wis dadi alat sing njanjeni kanggo kemajuan biomarker adhedhasar sistem ing AD. Pendekatan data-driven sing ora bias iki ngatur set data proteomik kompleks dadi klompok utawa "modul" protein sing diekspresikake bebarengan sing ana gandhengane karo jinis sel, organel, lan fungsi biologis tartamtu (11-13). Meh 12 studi proteomik jaringan sing sugih informasi wis ditindakake ing otak AD (13-23). Sakabèhé, analisa kasebut nuduhake manawa proteome jaringan otak AD njaga organisasi modular sing dikonservasi ing kohort independen lan sawetara wilayah kortikal. Kajaba iku, sawetara modul kasebut nuduhake owah-owahan sing bisa direproduksi ing kelimpahan sing gegandhengan karo AD ing set data, nggambarake patofisiologi macem-macem penyakit. Secara kolektif, temuan kasebut nuduhake titik jangkar sing janjeni kanggo panemuan proteome jaringan otak minangka biomarker berbasis sistem ing AD.
Kanggo ngowahi proteome jaringan otak AD dadi biomarker basis sistem sing migunani sacara klinis, kita gabungke jaringan asale otak kanthi analisis proteomik AD CSF. Pendekatan terintegrasi iki nyebabake identifikasi limang set biomarker CSF sing janjeni sing ana gandhengane karo macem-macem patofisiologi berbasis otak, kalebu sinapsis, pembuluh getih, mielinasi, inflamasi, lan disfungsi jalur metabolik. Kita kasil ngvalidasi panel biomarker iki liwat macem-macem analisis replikasi, kalebu luwih saka 500 conto CSF saka macem-macem penyakit neurodegeneratif. Analisis validasi kasebut kalebu mriksa target klompok ing CSF pasien kanthi AD asimtomatik (AsymAD) utawa nuduhake bukti akumulasi amiloid sing ora normal ing lingkungan kognitif normal. Analisis kasebut nyoroti heterogenitas biologis sing signifikan ing populasi AsymAD lan ngenali panandha panel sing bisa subtipe individu ing tahap wiwitan penyakit kasebut. Sakabèhé, asil kasebut minangka langkah kunci ing pangembangan alat biomarker protein adhedhasar macem-macem sistem sing bisa sukses ngatasi akeh tantangan klinis sing diadhepi AD.
Tujuan utama panliten iki yaiku kanggo ngenali biomarker cairan cerebrospinal anyar sing nggambarake macem-macem patofisiologi berbasis otak sing nyebabake AD. Gambar S1 njelasake metodologi riset kita, sing kalebu (i) analisis lengkap sing didorong dening temuan awal AD CSF lan proteome otak jaringan kanggo ngenali macem-macem biomarker penyakit CSF sing gegandhengan karo otak, lan (ii) replikasi sakteruse Biomarker kasebut ana ing sawetara cerebrospinal independen. klompok cairan. Panliten sing berorientasi panemuan diwiwiti kanthi analisis ekspresi diferensial CSF ing 20 individu sing normal kognitif lan 20 pasien AD ing Pusat Riset Penyakit Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). Diagnosis AD ditetepake minangka gangguan kognitif sing signifikan ing ngarsane Aβ1-42 sing kurang lan tingkat total tau lan p-tau sing munggah ing cairan serebrospinal [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (Tabel S1A). Kontrol (tegese MoCA, 26.7 ± 2.2) nduweni tingkat normal biomarker CSF.
CSF manungsa ditondoi kanthi macem-macem kelimpahan protein sing dinamis, ing ngendi albumin lan protein liyane sing akeh banget bisa nyegah deteksi protein sing dikarepake (24). Kanggo nambah ambane panemuan protein, kita mbusak 14 protein sing akeh banget saka saben sampel CSF sadurunge analisis spektrometri massa (MS) (24). Gunggunge 39.805 peptida diidentifikasi dening MS, sing dipetakan menyang 3691 proteomes ing 40 conto. Kuantifikasi protein ditindakake kanthi label tag massa tandem (TMT) (18, 25). Kanggo mutusake masalah data sing ilang, kita mung kalebu protein sing diukur paling sethithik 50% saka conto ing analisis sabanjure, saengga pungkasane ngitung 2875 protein. Amarga prabédan sing signifikan ing tingkat kelimpahan protein total, sampel kontrol sacara statistik dianggep minangka outlier (13) lan ora kalebu ing analisis sabanjure. Nilai kelimpahan saka 39 sampel sing isih disetel miturut umur, jender, lan kovarian batch (13-15, 17, 18, 20, 26).
Nggunakake analisis t-test statistik kanggo ngevaluasi ekspresi diferensial ing set data regresi, analisis iki nemtokake protein sing tingkat kelimpahan diganti kanthi signifikan (P <0.05) antarane kontrol lan kasus AD (Tabel S2A). Minangka ditampilake ing Figure 1A, turah mbrawah saka total 225 protein ing AD wis suda Ngartekno, lan turah mbrawah saka 303 protèin tambah Ngartekno. Protein sing diungkapake kanthi beda iki kalebu sawetara panandha AD cairan serebrospinal sing wis diidentifikasi sadurunge, kayata tau protein sing ana gandhengane karo mikrotubule (MAPT; P = 3.52 × 10-8), neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10-3), Protein sing gegandhengan karo pertumbuhan 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Protein Pengikat Asam Lemak 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Kitinase 3 kaya 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Granulin Neural (NRGN; P = 3.43 × 10-4) lan faktor pertumbuhan saraf VGF (VGF; P = 4.83 × 10-3) (4-6). Nanging, kita uga nemtokake target liyane sing penting banget, kayata inhibitor disosiasi GDP 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) lan ikatan kalsium modular sing gegandhengan karo SPARC 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Analisis Gene Ontology (GO) saka 225 protein sing dikurangi sacara signifikan ngungkapake hubungan sing cedhak karo proses cairan awak kayata metabolisme steroid, koagulasi getih, lan aktivitas hormon (Gambar 1B lan Tabel S2B). Ing kontras, protein tambah akeh 303 raket karo struktur sel lan metabolisme energi.
(A) Plot gunung geni nuduhake owah-owahan lipatan log2 (sumbu-x) relatif marang nilai P statistik -log10 (sumbu-y) sing dipikolehi dening uji-t, sing digunakake kanggo ndeteksi ekspresi diferensial antarane kontrol (CT) lan Kasus AD saka proteome CSF Kabeh protein. Protein kanthi tingkat sing dikurangi sacara signifikan (P <0,05) ing AD ditampilake kanthi warna biru, dene protein kanthi tingkat penyakit sing tambah akeh dituduhake kanthi warna abang. Protein sing dipilih diwenehi label. (B) Istilah GO ndhuwur sing ana hubungane karo protein dikurangi sacara signifikan (biru) lan tambah (abang) ing AD. Nuduhake telung istilah GO kanthi skor z paling dhuwur ing bidang proses biologi, fungsi molekul, lan komponen seluler. (C) MS ngukur tingkat MAPT ing sampel CSF (kiwa) lan korélasi karo sampel ELISA tau level (tengen). Koefisien korélasi Pearson kanthi nilai P sing cocog ditampilake. Amarga kekurangan data ELISA kanggo siji kasus AD, angka kasebut kalebu nilai kanggo 38 saka 39 kasus sing dianalisis. (D) Analisis kluster sing diawasi (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) nyetel P <0.01) ing kontrol lan AD CSF nemokake conto nggunakake 65 protein sing paling akeh diganti ing set data. Standarisasi, normalake.
Tingkat proteomik MAPT raket banget karo level ELISA tau sing diukur kanthi mandiri (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Gambar 1C), ndhukung validitas pangukuran MS kita. Sawise pencernaan trypsin ing tingkat protein prekursor amiloid (APP), peptida spesifik isoform sing dipetakan menyang terminal C Aβ1-40 lan Aβ1-42 ora bisa diionisasi kanthi efisien (27, 28). Mulane, peptida APP sing diidentifikasi ora ana hubungane karo level ELISA Aβ1-42. Kanggo ngevaluasi ekspresi diferensial saben kasus, kita nggunakake protein sing ditulis kanthi beda kanthi P <0.0001 [tingkat penemuan palsu (FDR) dikoreksi P <0.01] kanggo nindakake analisis kluster sing diawasi saka sampel (Tabel S2A). Kaya sing dituduhake ing Gambar 1D, 65 protein sing penting banget iki bisa nglumpukake conto kanthi bener miturut negara penyakit, kajaba siji kasus AD kanthi karakteristik kaya kontrol. Saka 65 protein kasebut, 63 tambah ing AD, dene mung loro (CD74 lan ISLR) mudhun. Secara total, analisis cairan cerebrospinal iki wis nemtokake atusan protein ing AD sing bisa dadi biomarker penyakit.
Banjur kita nindakake analisis jaringan independen saka proteome otak AD. Kohort otak panemuan iki kalebu korteks prefrontal dorsolateral (DLPFC) saka kontrol (n = 10), penyakit Parkinson (PD; n = 10), kasus AD / PD campuran (n = 10) lan AD (n = 10). ) Sampel. Emery Goizueta ADRC. Demografi saka 40 kasus kasebut wis diterangake sadurunge (25) lan diringkes ing Tabel S1B. Kita nggunakake TMT-MS kanggo nganalisa jaringan otak 40 iki lan kohort replikasi saka 27 kasus. Secara total, rong set data otak iki ngasilake 227,121 peptida unik, sing dipetakan dadi 12,943 proteomes (25). Mung protein sing diitung paling sethithik 50% kasus sing kalebu ing investigasi sabanjure. Set data panemuan pungkasan ngemot 8817 protein kuantitatif. Nyetel tingkat kelimpahan protein adhedhasar umur, jender, lan interval post-mortem (PMI). Analisis ekspresi diferensial saka set data sawise regresi nuduhake yen> tingkat protein 2000 diganti sacara signifikan [P <0.05, analisis varians (ANOVA)] ing loro utawa luwih kohort penyakit. Banjur, kita nindakake analisis kluster sing diawasi adhedhasar protein sing ditulis kanthi beda, lan P <0.0001 ing perbandingan AD / kontrol lan / utawa AD / PD (Gambar S2, A lan B, Tabel S2C). Protein 165 sing wis diowahi kanthi jelas nggambarake kasus patologi AD saka conto kontrol lan PD, ngonfirmasi owah-owahan khusus AD sing kuat ing kabeh proteome.
Kita banjur nggunakake algoritma sing disebut Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) kanggo nindakake analisis jaringan ing proteome otak sing ditemokake, sing ngatur set data dadi modul protein kanthi pola ekspresi sing padha (11-13). Analisis kasebut nemtokake 44 modul (M) protein sing diekspresikake, diurut lan dipérang saka sing paling gedhé (M1, n = 1821 protein) nganti sing paling cilik (M44, n = 34 protein) (Gambar 2A lan Tabel S2D) ). Kaya kasebut ing ndhuwur (13) Ngitung profil ekspresi perwakilan utawa protein karakteristik saben modul, lan hubungane karo negara penyakit lan patologi AD, yaiku, nggawe aliansi Registry Penyakit Alzheimer (CERAD) lan Skor Braak (Gambar 2B). Sakabèhé, modul 17 ana hubungane karo neuropatologi AD (P <0.05). Akeh modul sing gegandhengan karo penyakit iki uga sugih ing penanda khusus jinis sel (Gambar 2B). Kaya sing kasebut ing ndhuwur (13), pengayaan jinis sel ditemtokake kanthi nganalisa tumpang tindih modul lan dhaptar referensi gen spesifik jinis sel. Gen iki asalé saka data sing diterbitake ing neuron mouse terisolasi, sel endothelial lan glial. RNA sequencing (RNA-seq) eksperimen (29).
(A) Temokake WGCNA saka proteome otak. (B) Analisis midcorrelation biweight (BiCor) saka protein teken modular (komponen utama pisanan saka ekspresi protein modular) kanthi karakteristik neuropatologis AD (ndhuwur), kalebu skor CERAD (Aβ plaque) lan Braak (tau tangles). Intensitas korelasi positif (abang) lan negatif (biru) ditampilake kanthi peta panas rong warna, lan tanda bintang nuduhake signifikansi statistik (P <0.05). Gunakake Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (ngisor) kanggo netepake asosiasi jinis sel saben modul protein. Intensitas shading abang nuduhake derajat pengayaan jinis sel, lan tanda bintang nuduhake signifikansi statistik (P <0,05). Gunakake metode BH kanggo mbenerake nilai P sing diturunake saka FET. (C) analisis GO saka protein modular. Proses biologi sing paling raket dituduhake kanggo saben modul utawa klompok modul sing gegandhengan. oligo, oligodendrosit.
Sakumpulan limang modul astrocyte lan microglia sing ana gandhengane (M30, M29, M18, M24, lan M5) nuduhake korélasi positif sing kuat karo neuropatologi AD (Gambar 2B). Analisis ontologi ngubungake modul glial kasebut kanthi pertumbuhan sel, proliferasi, lan kekebalan (Gambar 2C lan Tabel S2E). Loro modul glial tambahan, M8 lan M22, uga banget upregulated ing penyakit. M8 ana hubungane banget karo jalur reseptor kaya Toll, kaskade sinyal sing nduwe peran penting ing respon imun bawaan (30). Ing wektu sing padha, M22 raket banget karo modifikasi pasca-translasi. M2, sing sugih ing oligodendrocytes, nuduhake korelasi positif sing kuat karo patologi AD lan sambungan ontologis karo sintesis nukleosida lan replikasi DNA, sing nuduhake proliferasi sel sing luwih apik ing penyakit. Sakabèhé, temuan kasebut ndhukung elevasi modul glial sing sadurunge wis diamati ing proteome jaringan AD (13, 17). Saiki ditemokake manawa akeh modul glial sing gegandhengan karo AD ing jaringan nuduhake tingkat ekspresi sing luwih murah ing kontrol lan kasus PD, nyoroti kekhususan penyakit sing munggah ing AD (Gambar S2C).
Mung papat modul ing proteome jaringan kita (M1, M3, M10, lan M32) sing ana hubungane banget karo patologi AD (P <0.05) (Gambar 2, B lan C). M1 lan M3 sugih ing tandha neuron. M1 ana hubungane banget karo sinyal sinaptik, dene M3 ana hubungane karo fungsi mitokondria. Ora ana bukti pengayaan jinis sel kanggo M10 lan M32. M32 nggambarake sesambungan antarane M3 lan metabolisme sel, dene M10 ana hubungane karo pertumbuhan sel lan fungsi mikrotubulus. Dibandhingake karo AD, kabeh papat modul tambah ing kontrol lan PD, menehi owah-owahan AD khusus penyakit (Gambar S2C). Sakabèhé, asil kasebut ndhukung penurunan modul kaya neuron sing sadurunge wis diamati ing AD (13, 17). Ringkesan, analisis jaringan proteome otak sing ditemokake ngasilake modul AD-spesifik sing diowahi konsisten karo temuan sadurunge.
AD ditondoi dening tahap asimtomatik awal (AsymAD), ing ngendi individu nuduhake akumulasi amiloid tanpa penurunan kognitif klinis (5, 31). Tahap asimtomatik iki minangka jendela kritis kanggo deteksi dini lan intervensi. Kita sadurunge wis nuduhake pengawetan modular sing kuat saka AsymAD lan proteome jaringan otak AD ing set data independen (13, 17). Kanggo mesthekake yen jaringan otak sing saiki ditemokake konsisten karo temuan sadurunge, kita nganalisa pengawetan modul 44 ing set data replika saka 27 organisasi DLPFC. Organisasi kasebut kalebu kasus kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8) Lan AD (n = 9). Sampel kontrol lan AD kalebu ing analisis kohort otak panemuan kita (Tabel S1B), dene kasus AsymAD mung unik ing kohort replikasi. Kasus AsymAD iki uga teka saka bank otak Emory Goizueta ADRC. Sanajan kognisi normal nalika mati, tingkat amiloid ora normal (rata-rata CERAD, 2.8 ± 0.5) (Tabel S1B).
Analisis TMT-MS saka 27 jaringan otak iki ngasilake kuantifikasi 11,244 proteomes. Cacah pungkasan iki mung kalebu protein sing diukur paling ora 50% saka sampel. Set data replika iki ngemot 8638 (98.0%) saka 8817 protein sing dideteksi ing analisis otak panemuan kita, lan wis meh 3000 protein sing diganti sacara signifikan ing antarane kontrol lan kohort AD (P <0.05, sawise uji t pasangan Tukey kanggo analisis varian) ( Tabel S2F). Antarane protèin sing ditulis kanthi beda, 910 uga nuduhaké owah-owahan tingkat sing signifikan antara AD lan kasus kontrol proteome otak (P <0.05, sawise ANOVA Tukey dipasangake t-test). Wigati dicathet menawa 910 marker iki konsisten banget ing arah owah-owahan antarane proteomes (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Gambar S3A). Ing antarane protèin sing saya tambah, protèin kanthi owah-owahan sing paling konsisten ing antarane set data utamané minangka anggota modul M5 lan M18 sing sugih glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, lan GFAP). Antarane protein sing dikurangi, sing owah-owahan sing paling konsisten meh kabeh anggota modul M1 (NPTX2, VGF, lan RPH3A) sing ana gandhengane karo sinaps. Kita luwih verifikasi owah-owahan AD-related midkine (MDK), CD44, disekresi frizzled-related protein 1 (SFRP1) lan VGF dening western blotting (Gambar S3B). Analisis pengawetan modul nuduhake yen udakara 80% modul protein (34/44) ing proteome otak sacara signifikan disimpen ing set data replikasi (z-skor> 1.96, FDR dikoreksi P <0.05) (Gambar S3C). Patbelas modul kasebut khusus dilindhungi ing antarane rong proteomes (z-skor> 10, FDR dikoreksi P <1.0 × 10-23). Sakabèhé, panemuan lan réplikasi tingkat konsistensi sing dhuwur ing ekspresi diferensial lan komposisi modular antarane proteome otak nyoroti reproducibility saka owah-owahan ing protèin korteks frontal AD. Kajaba iku, uga dikonfirmasi manawa AsymAD lan penyakit sing luwih maju duwe struktur jaringan otak sing padha.
Analisis sing luwih rinci babagan ekspresi diferensial ing set data replikasi otak nyoroti tingkat owah-owahan protein AsymAD sing signifikan, kalebu total 151 protein sing diganti sacara signifikan antarane AsymAD lan kontrol (P <0.05) (Gambar S3D). Konsisten karo beban amiloid, APP ing otak AsymAD lan AD tambah akeh. MAPT mung owah-owahan sacara signifikan ing AD, sing konsisten karo tingkat kusut lan korélasi sing dikenal karo penurunan kognitif (5, 7). Modul-modul sing sugih glial (M5 lan M18) katon banget ing protein sing tambah ing AsymAD, dene modul M1 sing gegandhengan karo neuron minangka wakil saka protein sing mudhun ing AsymAD. Akeh tandha AsymAD iki nuduhake owah-owahan sing luwih gedhe ing penyakit gejala. Antarane panandha kasebut yaiku SMOC1, protein glial sing ana ing M18, sing ana gandhengane karo tumor otak lan pangembangan mata lan anggota awak (32). MDK minangka faktor pertumbuhan pengikat heparin sing ana hubungane karo pertumbuhan sel lan angiogenesis (33), anggota liyane M18. Dibandhingake karo klompok kontrol, AsymAD tambah akeh, banjur tambah akeh AD. Ing kontras, protein synaptic neuropentraxin 2 (NPTX2) dikurangi sacara signifikan ing otak AsymAD. NPTX2 sadurunge digandhengake karo neurodegenerasi lan nduweni peran sing diakoni ing mediasi sinapsis excitatory (34). Sakabèhé, asil iki nuduhake macem-macem owah-owahan protein preclinical beda ing AD sing katon kanggo kemajuan karo keruwetan penyakit.
Amarga kita wis entuk ambane jangkoan protein sing signifikan ing panemuan proteome otak, kita nyoba ngerteni luwih lengkap tumpang tindih karo transkriptom AD tingkat jaringan. Mulane, kita mbandhingake proteome otak sing ditemokake karo modul sing sadurunge digawe saka pangukuran microarray saka 18,204 gen ing AD (n = 308) lan kontrol (n = 157) jaringan DLPFC (13). tumpang tindih. Secara total, kita nemtokake 20 modul RNA sing beda-beda, akeh sing nuduhake pengayaan jinis sel tartamtu, kalebu neuron, oligodendrocytes, astrocytes, lan microglia (Gambar 3A). Owah-owahan pirang-pirang modul kasebut ing AD ditampilake ing Gambar 3B. Konsisten karo analisis tumpang tindih protein-RNA sadurunge nggunakake proteome MS sing luwih jero tanpa label (kira-kira 3000 protein) (13), umume modul 44 ing jaringan proteome otak sing ditemokake ana ing jaringan transkriptom Ora ana tumpang tindih sing signifikan. panemuan lan replikasi 34 modul protein sing disimpen banget ing proteome otak, mung 14 (~ 40%) sing lulus tes pas Fisher (FET) sing kabukten duwe tumpang tindih sing signifikan sacara statistik karo transkriptom (Gambar 3A). Kompatibel karo ndandani karusakan DNA (P-M25 lan P-M19), terjemahan protein (P-M7 lan P-M20), RNA binding/splicing (P-M16 lan P-M21) lan nargetake protein (P-M13 lan P- M23) ora tumpang tindih karo modul ing transcriptome. Mulane, sanajan set data proteome sing luwih jero digunakake ing analisis tumpang tindih saiki (13), sebagian besar proteome jaringan AD ora dipetakan menyang jaringan transkriptom.
(A) Hypergeometric FET nduduhake pengayaan penanda khusus jinis sel ing modul RNA saka transkriptom AD (ndhuwur) lan tingkat tumpang tindih antarane modul RNA (sumbu-x) lan protein (sumbu-y) saka otak AD. (ngisor). Intensitas shading abang nuduhake tingkat pengayaan jinis sel ing panel ndhuwur lan intensitas tumpang tindih modul ing panel ngisor. Tanda bintang nuduhake signifikansi statistik (P <0,05). (B) Tingkat korélasi antarane gen karakteristik saben modul transkriptom lan status AD. Modul ing sisih kiwa ana hubungane paling negatif karo AD (biru), lan ing sisih tengen ana hubungane paling positif karo AD (abang). Nilai P sing dikoreksi BH sing diowahi log nuduhake tingkat signifikansi statistik saben korélasi. (C) Modul tumpang tindih sing signifikan kanthi pengayaan jinis sel sing dienggo bareng. (D) Analisis korelasi saka owah-owahan lipatan log2 saka protein label (sumbu-x) lan RNA (sumbu-y) ing modul tumpang tindih. Koefisien korélasi Pearson kanthi nilai P sing cocog ditampilake. Mikro, mikroglia; benda langit, astrosit. CT, kontrol.
Umume modul protein lan RNA sing tumpang tindih nuduhake profil pengayaan jinis sel sing padha lan arah pangowahan AD sing konsisten (Gambar 3, B lan C). Ing tembung liya, modul M1 sing gegandhengan karo sinaps saka proteome otak (PM1) dipetakan menyang telung modul RNA homolog kaya neuronal (R-M1, R-M9 lan R-M16), sing ana ing AD tingkat suda. Kajaba iku, modul protein M5 lan M18 sing sugih glial tumpang tindih karo modul RNA sing sugih ing astrosit lan penanda mikroglial (R-M3, R-M7, lan R-M10) lan kena pengaruh penyakit Tambah. Fitur modular sing dituduhake ing antarane rong set data kasebut luwih ndhukung pengayaan jinis sel lan owah-owahan sing gegandhengan karo penyakit sing wis diamati ing proteome otak. Nanging, kita mirsani akeh beda sing signifikan ing antarane RNA lan tingkat protein saka tandha individu ing modul sing dienggo bareng iki. Analisis korélasi ekspresi diferensial proteomik lan transkriptomi molekul ing modul sing tumpang tindih kasebut (Gambar 3D) nyoroti inkonsistensi iki. Contone, APP lan sawetara protein modul glial liyane (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, lan SFRP1) nuduhake peningkatan sing signifikan ing proteome AD, nanging meh ora ana owah-owahan ing transkriptom AD. Owah-owahan spesifik protein kasebut bisa uga ana hubungane karo plak amiloid (23, 35), nyorot proteome minangka sumber owah-owahan patologis, lan owah-owahan kasebut bisa uga ora katon ing transkriptom.
Sawise nganalisa sacara mandiri otak lan proteom CSF sing ditemokake, kita nganakake analisis lengkap saka rong set data kanggo ngenali biomarker AD CSF sing ana hubungane karo patofisiologi jaringan otak. Pisanan kita kudu nemtokake tumpang tindih loro proteomes. Sanajan umume ditampa manawa CSF nggambarake owah-owahan neurokimia ing otak AD (4), tingkat tumpang tindih sing tepat antarane otak AD lan proteome CSF ora jelas. Kanthi mbandhingake jumlah produk gen sing dideteksi ing rong proteom, kita nemokake manawa meh 70% (n = 1936) protein sing diidentifikasi ing cairan cerebrospinal uga diukur ing otak (Gambar 4A). Umume protein sing tumpang tindih iki (n = 1721) dipetakan menyang salah siji saka 44 modul co-ekspresi saka set data otak panemuan (Gambar 4B). Kaya sing dikarepake, enem modul otak paling gedhe (M1 nganti M6) nuduhake tumpang tindih CSF paling gedhe. Nanging, ana modul otak sing luwih cilik (contone, M15 lan M29) sing entuk tingkat tumpang tindih sing ora dikarepke, luwih gedhe tinimbang modul otak kaping pindho ukurane. Iki menehi motivasi kanggo nggunakake cara sing luwih rinci, kanthi statistik kanggo ngetung tumpang tindih antarane otak lan cairan cerebrospinal.
(A lan B) Protein sing dideteksi ing otak panemuan lan set data CSF tumpang tindih. Sebagéan gedhé protein sing tumpang tindih iki digandhengake karo salah siji saka 44 modul co-expression saka jaringan co-expression otak. (C) Temokake tumpang tindih antarane proteome cairan cerebrospinal lan proteome jaringan otak. Saben baris saka peta panas nggambarake analisis tumpang tindih kapisah saka FET hypergeometric. Baris ndhuwur nggambarake tumpang tindih (warna abu-abu / ireng) antarane modul otak lan kabeh proteome CSF. Baris kapindho nggambarake yen tumpang tindih antarane modul otak lan protein CSF (diwarnai abang) sacara signifikan diatur ing AD (P <0.05). Baris katelu nuduhake yen tumpang tindih antarane modul otak lan protein CSF (shading biru) sacara signifikan mudhun ing AD (P <0.05). Gunakake metode BH kanggo mbenerake nilai P sing diturunake saka FET. (D) Panel modul lempitan adhedhasar asosiasi jinis sel lan istilah GO sing gegandhengan. Panel kasebut ngemot total 271 protein sing gegandhengan karo otak, sing nduweni ekspresi diferensial sing migunani ing proteome CSF.
Nggunakake FET siji-buntut, kita nemtokake pentinge tumpang tindih protein ing antarane proteome CSF lan modul otak individu. Analisis kasebut nuduhake manawa total modul otak 14 ing set data CSF duwe tumpang tindih sing signifikan sacara statistik (FDR disetel P <0.05), lan modul tambahan (M18) sing tumpang tindih cedhak karo signifikansi (FDR disetel P = 0.06) (Gambar 4C , baris ndhuwur). Kita uga kasengsem ing modul sing banget tumpang tindih karo protèin CSF sing ditulis kanthi beda. Mulane, kita nggunakake rong analisis FET tambahan kanggo nemtokake (i) protein CSF sing tambah akeh ing AD lan (ii) protein CSF mudhun sacara signifikan ing AD (P <0.05, dipasangake t test AD / kontrol) Modul otak kanthi tumpang tindih sing migunani. antarane wong-wong mau. Kaya sing dituduhake ing baris tengah lan ngisor Gambar 4C, analisis tambahan iki nuduhake yen 8 saka 44 modul otak tumpang tindih kanthi protein sing ditambahake ing AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, lan M38) . ), nalika mung rong modul (M6 lan M15) nuduhake tumpang tindih sing migunani karo protein suda ing AD CSF. Kaya sing dikarepake, kabeh 10 modul ana ing 15 modul kanthi tumpang tindih paling dhuwur karo proteome CSF. Mulane, kita nganggep yen modul 15 iki minangka sumber dhuwur saka biomarker CSF sing asale saka otak AD.
Kita lempitan 15 modul sing tumpang tindih iki dadi limang panel protein gedhe adhedhasar jarake ing diagram wit WGCNA lan hubungane karo jinis sel lan ontologi gen (Gambar 4D). Panel pisanan ngemot modul sing sugih ing tandha neuron lan protein sing ana gandhengane karo sinaps (M1 lan M12). Panel sinaptik ngemot total 94 protein, lan tingkat ing proteome CSF wis owah sacara signifikan, dadi sumber paling gedhe saka penanda CSF sing gegandhengan karo otak ing antarane limang panel kasebut. Klompok kapindho (M6 lan M15) nuduhake hubungan sing cedhak karo penanda sel endothelial lan awak vaskular, kayata "penyembuhan luka" (M6) lan "regulasi respon imun humoral" (M15). M15 uga ana hubungane banget karo metabolisme lipoprotein, sing ana hubungane karo endothelium (36). Panel vaskular ngemot 34 penanda CSF sing ana hubungane karo otak. Klompok katelu kalebu modul (M2 lan M4) sing ana hubungane karo marker oligodendrocyte lan proliferasi sel. Contone, istilah ontologi tingkat ndhuwur M2 kalebu "regulasi positif replikasi DNA" lan "proses biosintesis purin". Kangge, M4 kalebu "diferensiasi sel glial" lan "segregasi kromosom". Panel myelination ngemot 49 penanda CSF sing ana hubungane karo otak.
Klompok kaping papat ngemot paling akeh modul (M30, M29, M18, M24, lan M5), lan meh kabeh modul akeh banget karo microglia lan marker astrocyte. Kaya panel myelination, panel kaping papat uga ngemot modul (M30, M29, lan M18) sing ana hubungane karo proliferasi sel. Modul liyane ing grup iki ana hubungane banget karo istilah imunologis, kayata "proses efek imun" (M5) lan "regulasi respon imun" (M24). Klompok kekebalan glial ngemot 42 penanda CSF sing ana gandhengane karo otak. Pungkasan, panel pungkasan kalebu 52 spidol sing gegandhengan karo otak ing papat modul (M44, M3, M33, lan M38), kabeh ana ing awak sing ana hubungane karo panyimpenan energi lan metabolisme. Paling gedhé saka modul iki (M3) raket banget karo mitokondria lan sugih ing tandha khusus neuron. M38 minangka salah sawijining anggota modul sing luwih cilik ing metabolom iki lan uga nuduhake spesifik neuron moderat.
Sakabèhé, limang panel iki nggambarake macem-macem jinis sel lan fungsi ing korteks AD, lan sacara kolektif ngemot 271 penanda CSF sing gegandhengan karo otak (Tabel S2G). Kanggo ngevaluasi validitas asil MS kasebut, kita nggunakake proximity extension assay (PEA), teknologi berbasis antibodi ortogonal kanthi kapabilitas multiplexing, sensitivitas lan spesifisitas dhuwur, lan nganalisis maneh sampel cairan cerebrospinal sing ditemokake A subset saka 271 biomarker iki. (n = 36). Target 36 iki nduduhake owah-owahan ing pirang-pirang AD saka PEA, sing ana hubungane karo temuan basis MS (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), Kang banget verifikasi asil analisis MS lengkap kita (Gambar S4). ).
Tema biologi sing ditekanake dening limang klompok kita, saka sinyal sinaptik menyang metabolisme energi, kabeh ana hubungane karo patogenesis AD (1-3). Mulane, kabeh modul 15 sing ngemot panel kasebut ana hubungane karo patologi AD ing proteome otak sing ditemokake (Gambar 2B). Sing paling penting yaiku korélasi patologis positif sing dhuwur ing antarane modul glial kita lan korélasi patologis negatif sing kuat antarane modul neuronal paling gedhé (M1 lan M3). Analisis ekspresi diferensial saka proteome otak sing ditiru (Gambar S3D) uga nyorot protein glial sing asale saka M5 lan M18. Ing AsymAD lan AD gejala, protein glial sing paling akeh tambah lan sinapsis sing gegandhengan karo M1 Protein dikurangi paling akeh. Pengamatan kasebut nuduhake yen 271 tandha cairan cerebrospinal sing diidentifikasi ing limang klompok kasebut ana hubungane karo proses penyakit ing korteks AD, kalebu sing kedadeyan ing tahap awal asimtomatik.
Kanggo luwih nganalisa arah owah-owahan protein panel ing otak lan cairan balung mburi, kita nggambar ing ngisor iki kanggo saben modul tumpang tindih 15: (i) nemokake tingkat kelimpahan modul ing set data otak lan (ii) modul protein Bentenane kasebut dituduhake ing cairan serebrospinal (Gambar S5). Kaya kasebut sadurunge, WGCNA digunakake kanggo nemtokake kelimpahan modul utawa nilai protein karakteristik ing otak (13). Peta gunung geni digunakake kanggo njlèntrèhaké ekspresi diferensial saka protein modular ing cairan serebrospinal (AD / kontrol). Angka kasebut nuduhake yen telu saka limang panel nuduhake tren ekspresi sing beda ing otak lan cairan balung mburi. Loro modul panel sinaps (M1 lan M12) nuduhake penurunan tingkat kelimpahan ing otak AD, nanging tumpang tindih kanthi protein sing tambah ing AD CSF (Gambar S5A). Modul-modul sing ana gandhengane karo neuron sing ngemot metabolom (M3 lan M38) nuduhake pola ekspresi cairan otak lan serebrospinal sing padha ora konsisten (Gambar S5E). Panel vaskular uga nuduhake tren ekspresi sing beda-beda, sanajan modul kasebut (M6 lan M15) mundhak kanthi moderat ing otak AD lan mudhun ing CSF sing lara (Gambar S5B). Rong panel sing isih ana ngemot jaringan glial gedhe sing proteine terus diatur ing loro kompartemen kasebut (Gambar S5, C lan D).
Elinga yen tren iki ora umum kanggo kabeh panandha ing panel kasebut. Contone, panel sinaptik kalebu sawetara protein sing dikurangi sacara signifikan ing otak AD lan CSF (Gambar S5A). Antarane tandha cairan cerebrospinal sing diatur mudhun yaiku NPTX2 lan VGF saka M1, lan kromogranin B saka M12. Nanging, senadyan pangecualian kasebut, umume tandha sinaptik kita munggah ing cairan spinal AD. Sakabèhé, analisis kasebut bisa mbédakaké tren sing signifikan sacara statistik ing tingkat cairan otak lan serebrospinal ing saben limang panel kita. Tren kasebut nyoroti hubungan rumit lan asring beda antarane otak lan ekspresi protein CSF ing AD.
Banjur, kita nggunakake analisis replikasi MS kanthi dhuwur (replikasi CSF 1) kanggo nyempitake 271 set biomarker menyang target sing paling njanjeni lan bisa direproduksi (Gambar 5A). Salinan CSF 1 ngemot total 96 conto saka Emory Goizueta ADRC, kalebu kontrol, AsymAD, lan kohort AD (Tabel S1A). Kasus AD iki ditondoi dening penurunan kognitif entheng (tegese MoCA, 20.0 ± 3.8), lan owah-owahan ing biomarker AD dikonfirmasi ing cairan cerebrospinal (Tabel S1A). Beda karo analisis CSF sing ditemokake, replikasi iki ditindakake kanthi nggunakake metode MS "single-shot" sing luwih efisien lan dhuwur (tanpa fraksinasi off-line), kalebu protokol persiapan sampel sing disederhanakake sing ngilangi kabutuhan immunodepletion saka sampel individu. . Nanging, "saluran tambahan" sing kurang kekebalan digunakake kanggo nggedhekake sinyal protein sing kurang akeh (37). Sanajan nyuda total jangkoan proteome, metode siji-shot iki nyuda wektu mesin kanthi signifikan lan nambah jumlah sampel sing dilabel TMT sing bisa dianalisis sregep (17, 38). Secara total, analisis kasebut ngidentifikasi 6,487 peptida, sing dipetakan dadi 1,183 proteomes ing 96 kasus. Kaya analisis CSF sing ditemokake, mung protein sing diukur paling sethithik 50% saka conto sing kalebu ing petungan sabanjure, lan data kasebut mundur kanggo efek umur lan jender. Iki nyebabake kuantifikasi pungkasan saka 792 proteomes, 95% uga diidentifikasi ing set data CSF sing ditemokake.
(A) Target protein CSF sing gegandhengan karo otak diverifikasi ing kohort CSF replikasi pisanan lan kalebu ing panel pungkasan (n = 60). (B nganti E) Tingkat biomarker panel (komposit z-skor) diukur ing papat replikasi CSF kohort. Tes t dipasangake utawa ANOVA kanthi koreksi pasca Tukey digunakake kanggo ngevaluasi signifikansi statistik saka owah-owahan sing akeh banget ing saben analisis replika. CT, kontrol.
Amarga kita kasengsem banget kanggo verifikasi target CSF sing gegandhengan karo otak 271 liwat analisis lengkap, kita bakal mbatesi pemeriksaan luwih lanjut babagan proteome sing ditiru iki kanggo penanda kasebut. Ing antarane 271 protein kasebut, 100 dideteksi ing replikasi CSF 1. Gambar S6A nuduhake ekspresi diferensial saka 100 panandha tumpang tindih antarane kontrol lan sampel replikasi AD. Histone sinaptik lan metabolit mundhak paling akeh ing AD, dene protein vaskular nyuda paling akeh ing penyakit. Akèh-akèhé saka 100 tandha tumpang tindih (n = 70) maintained arah padha owah-owahan ing rong set data (Figure S6B). Penanda CSF sing gegandhengan karo otak 70 sing divalidasi (Tabel S2H) umume nggambarake tren ekspresi panel sing diamati sadurunge, yaiku, regulasi mudhun protein vaskular lan regulasi munggah kabeh panel liyane. Mung 10 saka 70 protein sing divalidasi iki nuduhake owah-owahan ing kelimpahan AD sing mbantah tren panel kasebut. Kanggo ngasilake panel sing paling nggambarake tren sakabèhé otak lan cairan cerebrospinal, kita ngilangi 10 protein kasebut saka panel kapentingan sing pungkasane diverifikasi (Gambar 5A). Mula, panel kita pungkasane kalebu total 60 protein sing diverifikasi ing rong kohort AD CSF independen nggunakake persiapan sampel lan analisis platform MS sing beda. Plot ekspresi z-skor panel pungkasan kasebut ing kontrol salinan CSF 1 lan kasus AD dikonfirmasi gaya panel sing diamati ing kohort CSF sing ditemokake (Gambar 5B).
Ing antarane 60 protein kasebut, ana molekul sing dikenal ana hubungane karo AD, kayata osteopontin (SPP1), yaiku sitokin pro-inflamasi sing wis digandhengake karo AD ing akeh studi (39-41), lan GAP43, Protein sinaptik. sing jelas disambung karo neurodegeneration (42). Protein sing paling diverifikasi kanthi lengkap yaiku penanda sing ana gandhengane karo penyakit neurodegeneratif liyane, kayata amyotrophic lateral sclerosis (ALS) related superoxide dismutase 1 (SOD1) lan Parkinson's disease related desaccharase (PARK7). Kita uga wis verifikasi manawa akeh panandha liyane, kayata SMOC1 lan protein sinyal lampiran membran sing sugih otak 1 (BASP1), wis mbatesi tautan sadurunge menyang neurodegenerasi. Wigati dicathet yen amarga kelimpahan sakabèhé sing kurang ing proteome CSF, angel kanggo nggunakake metode deteksi siji-shot kanthi dhuwur iki kanggo ndeteksi MAPT lan protein sing gegandhengan karo AD liyane (contone, NEFL lan NRGN). ) ( 43, 44).
Kita banjur mriksa 60 panandha panel prioritas iki ing telung analisis ulangan tambahan. Ing CSF Copy 2, kita nggunakake TMT-MS siji kanggo nganalisa kohort independen saka 297 kontrol lan sampel AD saka Emory Goizueta ADRC (17). Replikasi CSF 3 kalebu reanalisis data TMT-MS sing kasedhiya saka kontrol 120 lan pasien AD saka Lausanne, Swiss (45). Kita ndeteksi luwih saka rong pertiga saka 60 tandha prioritas ing saben dataset. Sanajan sinau Swiss nggunakake platform MS lan metode kuantifikasi TMT sing beda-beda (45, 46), kita ngasilake tren panel kanthi kuat ing rong analisis bola-bali (Gambar 5, C lan D, lan Tabel S2, I, lan J). Kanggo ngevaluasi spesifik penyakit saka klompok kita, kita nggunakake TMT-MS kanggo nganalisa set data replikasi kaping papat (replikasi CSF 4), sing kalebu ora mung kontrol (n = 18) lan AD (n = 17) kasus, nanging uga PD ( n = 14)), sampel ALS (n = 18) lan demensia frontotemporal (FTD) (n = 11) (Tabel S1A). Kita kasil ngitung meh rong pertiga saka protein panel ing kohort iki (38 saka 60). Asil kasebut nyorot owah-owahan khusus AD ing kabeh limang panel biomarker (Gambar 5E lan Tabel S2K). Tambah ing klompok metabolit nuduhake spesifik AD paling kuat, ngiring dening klompok myelination lan glial. Kanggo sing luwih cilik, FTD uga nuduhake paningkatan ing antarane panel kasebut, sing bisa uga nggambarake owah-owahan jaringan potensial sing padha (17). Ing kontras, ALS lan PD nuduhake meh padha myelination, glial, lan profil metabolom minangka klompok kontrol. Sakabèhé, sanajan ana beda ing persiapan sampel, platform MS, lan cara kuantifikasi TMT, analisis bola-bali iki nuduhake manawa panandha panel prioritas kita duwe owah-owahan khusus AD sing konsisten ing luwih saka 500 conto CSF unik.
Neurodegenerasi AD wis diakoni sacara wiyar sawetara taun sadurunge wiwitan gejala kognitif, saéngga ana kabutuhan mendesak kanggo biomarker AsymAD (5, 31). Nanging, luwih akeh bukti nuduhake yen biologi AsymAD adoh saka homogen, lan interaksi kompleks risiko lan daya tahan nyebabake beda individu gedhe ing perkembangan penyakit sabanjure (47). Sanajan digunakake kanggo ngenali kasus AsymAD, tingkat biomarker CSF inti (Aβ1-42, total tau lan p-tau) durung kabukten bisa prédhiksi kanthi andal sapa sing bakal ngalami demensia (4, 7), nuduhake luwih akeh. perlu kanggo nyakup alat biomarker sakabehe adhedhasar macem-macem aspèk fisiologi otak kanggo akurat stratify risiko populasi iki. Mulane, kita banjur nganalisa panel biomarker sing divalidasi AD ing populasi AsymAD saka salinan CSF 1. Kasus 31 AsymAD iki nuduhake tingkat biomarker inti sing ora normal (rasio Aβ1-42 / total tau ELISA, <5.5) lan kognisi lengkap (tegese MoCA, 27.1). ± 2.2) (Tabel S1A). Kajaba iku, kabeh individu sing duwe AsymAD duwe skor demensia klinis 0, sing nuduhake yen ora ana bukti penurunan kinerja kognitif utawa fungsional saben dina.
Kita pisanan nganalisa tingkat panel sing divalidasi ing kabeh 96 replika CSF 1, kalebu kohort AsymAD. Kita nemokake manawa sawetara panel ing grup AsymAD duwe owah-owahan kaya AD sing signifikan, panel vaskular nuduhake tren mudhun ing AsymAD, dene kabeh panel liyane nuduhake tren munggah (Gambar 6A). Mulane, kabeh panel nuduhake korélasi sing signifikan banget karo ELISA Aβ1-42 lan tingkat tau total (Gambar 6B). Ing kontras, korélasi antarane klompok lan skor MoCA relatif kurang. Salah sawijining panemuan sing luwih nggumunake saka analisis kasebut yaiku akeh panel panel ing kohort AsymAD. Minangka ditampilake ing Figure 6A, tingkat panel saka klompok AsymAD biasane ngliwati tingkat panel saka grup kontrol lan grup AD, nuduhake variabilitas relatif dhuwur. Kanggo luwih njelajah heterogenitas AsymAD iki, kita nggunakake analisis Multidimensional Scaling (MDS) kanggo 96 replikasi CSF 1 kasus. Analisis MDS ngidini kanggo nggambarake podho antarane kasus adhedhasar variabel tartamtu ing set data. Kanggo analisis kluster iki, kita mung nggunakake panandha panel sing divalidasi sing nduweni owah-owahan sing signifikan sacara statistik (P <0.05, AD / kontrol) ing tingkat panemuan CSF lan replikasi 1 proteome (n = 29) (Tabel S2L). Analisis iki ngasilake clustering spasial sing jelas ing antarane kontrol lan kasus AD (Gambar 6C). Ing kontras, sawetara kasus AsymAD jelas clustered ing grup kontrol, nalika liyane dumunung ing kasus AD. Kanggo luwih njelajah heterogenitas AsymAD iki, kita nggunakake peta MDS kanggo nemtokake rong klompok kasus AsymAD iki. Klompok pisanan kalebu kasus AsymAD clustered nyedhaki kontrol (n = 19), nalika klompok kapindho ditondoi dening kasus AsymAD karo profil panandha nyedhaki AD (n = 12).
(A) Tingkat ekspresi (z-skor) klompok biomarker CSF ing kabeh sampel 96 ing replikasi CSF 1 kohort, kalebu AsymAD. Analisis varian karo koreksi pasca Tukey digunakake kanggo ngevaluasi signifikansi statistik owah-owahan kelimpahan panel. (B) Analisis korelasi tingkat kelimpahan protein panel (z-skor) kanthi skor MoCA lan level tau total ing sampel ELISA Aβ1-42 lan salinan CSF 1. Koefisien korélasi Pearson kanthi nilai P sing cocog ditampilake. (C) MDS saka 96 kasus salinan CSF 1 adhedhasar tingkat kelimpahan 29 panandha panel sing divalidasi, sing diganti sacara signifikan ing set data panemuan lan salinan CSF 1 [P <0.05 AD / kontrol (CT)]. Analisis iki digunakake kanggo mbagi klompok AsymAD dadi subkelompok kontrol (n = 19) lan AD (n = 12). (D) Plot gunung geni nuduhake ekspresi diferensial kabeh CSF replikasi 1 protein karo log2 lipat owah-owahan (x-sumbu) relatif kanggo -log10 nilai statistik P antarane loro subgroups AsymAD. Biomarker panel diwarnai. (E) Replikasi CSF 1 tingkat kelimpahan biomarker klompok pilihan dibedakake antarane subkelompok AsymAD. Analisis varians post-adjusted Tukey digunakake kanggo netepake signifikansi statistik.
Kita mriksa ekspresi protein diferensial antarane kontrol kasebut lan kasus AsymAD kaya AD (Gambar 6D lan Tabel S2L). Peta gunung geni sing diasilake nuduhake yen 14 panandha panel wis owah sacara signifikan ing antarane rong klompok kasebut. Sebagéan gedhé panandha iki minangka anggota sinaps lan metabolom. Nanging, SOD1 lan substrat protein kinase C sing sugih alanine myristoylated (MARCKS), sing dadi anggota kelompok imun myelin lan glial, uga kalebu ing grup iki (Gambar 6, D lan E). Panel vaskular uga nyumbang loro tandha sing dikurangi sacara signifikan ing klompok AsymAD kaya AD, kalebu protein pengikat AE 1 (AEBP1) lan nglengkapi anggota kulawarga C9. Ora ana bedane sing signifikan antarane kontrol lan subkelompok AsymAD kaya AD ing ELISA AB1-42 (P = 0.38) lan p-tau (P = 0.28), nanging ana prabédan sing signifikan ing total level tau (P = 0.0031). ) (Gambar S7). Ana sawetara panandha panel sing nuduhake yen owah-owahan ing antarane rong subgrup AsymAD luwih penting tinimbang level tau total (contone, YWHAZ, SOD1, lan MDH1) (Gambar 6E). Sakabèhé, asil kasebut nuduhake manawa panel sing wis divalidasi bisa ngemot biomarker sing bisa subtipe lan stratifikasi risiko potensial pasien sing nandhang penyakit asimtomatik.
Ana kabutuhan mendesak kanggo alat biomarker adhedhasar sistem kanggo ngukur lan target macem-macem patofisiologi sing ana ing mburi AD. Piranti kasebut samesthine ora mung ngganti kerangka diagnostik AD kita, nanging uga ningkatake adopsi strategi perawatan khusus pasien sing efektif (1, 2). Kanggo tujuan iki, kita ngetrapake pendekatan proteomik komprehensif sing ora bias menyang otak AD lan CSF kanggo ngenali biomarker CSF berbasis web sing nggambarake macem-macem patofisiologi berbasis otak. Analisis kita ngasilake limang panel biomarker CSF, sing (i) nggambarake sinapsis, pembuluh getih, myelin, disfungsi kekebalan lan metabolisme; (ii) nduduhake reproduktifitas sing kuat ing platform MS sing beda; (iii) Tampilake owah-owahan spesifik penyakit sing progresif ing tahap awal lan pungkasan AD. Sakabèhé, panemuan iki minangka langkah sing njanjeni kanggo pangembangan alat biomarker sing maneka warna, dipercaya, lan berorientasi web kanggo riset AD lan aplikasi klinis.
Asil kita nduduhake organisasi proteome jaringan otak AD sing dikonservasi lan ndhukung panggunaane minangka jangkar kanggo pangembangan biomarker adhedhasar sistem. Analisis kita nuduhake manawa rong set data TMT-MS independen sing ngemot otak AD lan AsymAD duwe modularitas sing kuat. Temuan kasebut ngluwihi karya sadurunge, nuduhake pelestarian modul kuat luwih saka jaringan otak 2,000 saka macem-macem kohort independen ing korteks frontal, parietal, lan temporal (17). Jaringan konsensus iki nggambarake macem-macem owah-owahan sing gegandhengan karo penyakit sing diamati ing riset saiki, kalebu nambah modul inflamasi sing sugih glial lan nyuda modul sing sugih neuron. Kaya riset saiki, jaringan skala gedhe iki uga nduweni owah-owahan modular sing signifikan ing AsymAD, nuduhake macem-macem patofisiologi preclinical sing beda (17).
Nanging, ing kerangka basis sistem sing konservatif banget iki, ana heterogenitas biologis sing luwih apik, utamane ing antarane individu ing tahap awal AD. Panel biomarker kita bisa nggambarake rong subkelompok ing AsymAD, sing nuduhake ekspresi diferensial sing signifikan saka pirang-pirang marker CSF. Klompok kita bisa nyorot beda biologis antarane rong subkelompok kasebut, sing ora jelas ing tingkat biomarker AD inti. Dibandhingake karo klompok kontrol, rasio Aβ1-42 / total tau saka individu AsymAD iki ora normal. Nanging, mung tingkat tau total sing beda banget ing antarane rong subkelompok AsymAD, dene tingkat Aβ1-42 lan p-tau tetep bisa dibandhingake. Amarga tau CSF sing dhuwur katon minangka prediktor gejala kognitif sing luwih apik tinimbang tingkat Aβ1-42 (7), kita ngira yen loro kohort AsymAD bisa duwe risiko sing beda kanggo perkembangan penyakit. Amarga ukuran sampel sing winates saka AsymAD kita lan kekurangan data longitudinal, riset luwih lanjut dibutuhake kanggo nggawe kesimpulan kanthi yakin. Nanging, asil kasebut nuduhake manawa panel CSF adhedhasar sistem bisa ningkatake kemampuan kita kanggo stratifikasi individu kanthi efektif sajrone tahap penyakit asimtomatik.
Sakabèhé, temuan kita ndhukung peran sawetara fungsi biologis ing patogenesis AD. Nanging, metabolisme energi sing disregulasi dadi tema sing penting ing kabeh limang panel label sing wis divalidasi. Protein metabolik, kayata hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) lan lactate dehydrogenase A (LDHA), minangka biomarker sinaptik sing paling kuat sing divalidasi, nuduhake yen paningkatan AD CSF minangka jinis sing bisa direproduksi banget. Pembuluh getih lan panel glial uga ngemot sawetara tandha sing melu metabolisme zat oksidatif. Temuan kasebut konsisten karo peran kunci sing dimainake dening proses metabolisme ing kabeh otak, ora mung kanggo nyukupi kebutuhan energi neuron sing dhuwur, nanging uga kanggo nyukupi kebutuhan energi astrosit lan sel glial liyane (17, 48). Asil kita ndhukung bukti sing saya tambah akeh yen owah-owahan ing potensial redoks lan gangguan jalur energi bisa dadi hubungan inti antarane sawetara proses kunci sing ana ing patogenesis AD, kalebu gangguan mitokondria, inflamasi glial-mediated, lan karusakan Vaskular (49). Kajaba iku, biomarker cairan serebrospinal metabolik ngemot akeh protein sing beda-beda ing antarane kontrol kita lan subkelompok AsymAD kaya AD, sing nuduhake yen gangguan jalur energi lan redoks kasebut bisa uga kritis ing tahap praklinis penyakit kasebut.
Tren panel cairan otak lan cerebrospinal sing beda-beda sing wis diamati uga duwe implikasi biologis sing menarik. Sinapsis lan metabolom sing sugih ing neuron nuduhake penurunan tingkat ing otak AD lan tambah akeh cairan serebrospinal. Amarga neuron sugih ing mitokondria sing ngasilake energi ing sinapsis kanggo nyedhiyakake energi kanggo sinyal khusus sing akeh (50), kemiripan profil ekspresi saka rong klompok neuron kasebut samesthine. Mundhut neuron lan ekstrusi sel sing rusak bisa nerangake tren panel otak lan CSF kasebut ing penyakit mengko, nanging ora bisa nerangake owah-owahan panel awal sing kita deleng (13). Salah sawijining panjelasan kanggo temuan kasebut ing penyakit asimtomatik awal yaiku pruning sinaptik sing ora normal. Bukti anyar ing model tikus nuduhake manawa fagositosis sinaptik sing dimediasi mikroglia bisa diaktifake kanthi ora normal ing AD lan nyebabake mundhut sinaps awal ing otak (51). Materi sinaptik sing dibuwang iki bisa nglumpukake ing CSF, mula kita mirsani paningkatan CSF ing panel neuron. Pruning sinaptik sing dimediasi kekebalan uga bisa uga nerangake paningkatan protein glial sing ditemokake ing otak lan cairan cerebrospinal sajrone proses penyakit. Saliyane pruning sinaptik, kelainan sakabèhé ing jalur eksositik uga bisa nyebabake ekspresi otak lan CSF sing beda saka penanda neuron. Sawetara panliten nuduhake yen isi eksosom ing patogenesis otak AD wis owah (52). Jalur ekstraselular uga melu proliferasi Aβ (53, 54). Wigati dicathet yen penindasan sekresi eksosomal bisa nyuda patologi kaya AD ing model tikus transgenik AD (55).
Ing wektu sing padha, protein ing panel vaskular nuduhake paningkatan moderat ing otak AD, nanging sacara signifikan nyuda ing CSF. Disfungsi penghalang getih-otak (BBB) bisa uga nerangake temuan kasebut. Akeh pasinaon manungsa postmortem independen wis nuduhake risak BBB ing AD (56, 57). Panaliten kasebut ngonfirmasi macem-macem kegiatan abnormal sing ngubengi lapisan sel endothelial sing ditutup kanthi rapet, kalebu kebocoran kapiler otak lan akumulasi perivaskular protein sing digawa menyang getih (57). Iki bisa menehi panjelasan prasaja kanggo protein vaskular munggah pangkat ing otak, nanging ora bisa kanthi lengkap nerangake panipisan protein padha ing adi cerebrospinal. Salah sawijining kemungkinan yaiku sistem saraf pusat kanthi aktif ngisolasi molekul kasebut kanggo ngatasi masalah inflamasi lan stres oksidatif. Pengurangan sawetara protein CSF sing paling abot ing panel iki, utamane sing melu regulasi lipoprotein, ana hubungane karo inhibisi tingkat inflamasi sing mbebayani lan proses neuroprotective spesies oksigen reaktif. Iki bener kanggo Paroxonase 1 (PON1), enzim pengikat lipoprotein sing tanggung jawab kanggo nyuda tingkat stres oksidatif ing sirkulasi (58, 59). Alpha-1-microglobulin/bikunin prekursor (AMBP) minangka marker liyane sing dikontrol sacara signifikan saka klompok vaskular. Iki minangka prekursor saka bikunin transporter lipid, sing uga melu nyuda inflamasi lan Proteksi neurologis (60, 61).
Senadyan macem-macem hipotesis sing menarik, ora bisa ndeteksi langsung mekanisme penyakit biokimia minangka watesan sing kondhang ing analisis proteomik sing didorong dening panemuan. Mula, riset luwih lanjut dibutuhake kanggo nemtokake mekanisme sing ana ing mburi panel biomarker kasebut. Kanggo maju menyang pangembangan analisis klinis berbasis MS, arah mangsa ngarep uga mbutuhake cara kuantitatif sing ditargetake kanggo verifikasi biomarker skala gedhe, kayata pemantauan reaksi selektif utawa paralel (62). Kita bubar nggunakake pemantauan reaksi paralel (63) kanggo validasi akeh owah-owahan protein CSF sing diterangake ing kene. Saperangan target panel prioritas diukur kanthi akurasi sing signifikan, kalebu YWHAZ, ALDOA, lan SMOC1, sing padha peta menyang sinaps, metabolisme, lan panel inflamasi (63). Independent Data Acquisition (DIA) lan strategi basis MS liyane bisa uga migunani kanggo verifikasi target. Budi et al. (64) Bubar kasebut nuduhake yen ana tumpang tindih sing signifikan ing antarane biomarker AD sing diidentifikasi ing set data panemuan CSF kita lan set data DIA-MS independen, sing dumadi saka meh 200 conto CSF saka telung kohort Eropa sing beda. Panaliten anyar iki ndhukung potensial panel kita kanggo ngowahi dadi deteksi basis MS sing dipercaya. Antibodi tradisional lan deteksi basis aptamer uga penting kanggo pangembangan biomarker kunci AD. Amarga kelimpahan CSF sing kurang, luwih angel ndeteksi biomarker kasebut kanthi nggunakake metode MS-throughput dhuwur. NEFL lan NRGN minangka rong conto biomarker CSF sing kurang akeh, sing dipetakan menyang panel ing analisis lengkap kita, nanging ora bisa dideteksi kanthi dipercaya nggunakake strategi MS tunggal. Sastranegara nargetake adhedhasar macem-macem antibodi, kayata PEA, bisa ningkatake transformasi klinis panandha kasebut.
Sakabèhé, panliten iki nyedhiyakake pendekatan proteomik sing unik kanggo identifikasi lan verifikasi biomarker CSF AD adhedhasar sistem sing beda-beda. Ngoptimalake panel panandha iki ing klompok AD tambahan lan platform MS bisa uga njanjeni stratifikasi lan perawatan risiko AD. Pasinaon sing ngevaluasi tingkat longitudinal panel kasebut sajrone wektu uga kritis kanggo nemtokake kombinasi marker sing paling apik stratifies risiko penyakit awal lan owah-owahan ing keruwetan penyakit.
Kajaba 3 conto sing disalin dening CSF, kabeh conto CSF sing digunakake ing panliten iki diklumpukake ing sangisore naungan Emory ADRC utawa lembaga riset sing raket. Gunggunge papat set sampel Emory CSF digunakake ing studi proteomik kasebut. Kohort CSF ditemokake ngemot conto saka 20 kontrol sehat lan 20 pasien AD. Salinan CSF 1 kalebu conto saka 32 kontrol sehat, 31 individu AsymAD, lan 33 individu AD. Salinan CSF 2 ngemot 147 kontrol lan 150 conto AD. Replikasi CSF multi-penyakit 4 kohort kalebu 18 kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, lan 11 sampel FTD. Miturut persetujuan sing disetujoni dening Emory University Institutional Review Board, kabeh peserta sinau Emory entuk persetujuan kanthi informed. Miturut 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cairan serebrospinal dikumpulake lan disimpen kanthi tusukan lumbar. Pasien Kontrol lan AsymAD lan AD nampa penilaian kognitif standar ing Klinik Neurologi Kognitif Emory utawa Goizueta ADRC. Sampel cairan cerebrospinal dites dening INNO-BIA AlzBio3 Luminex kanggo ELISA Aβ1-42, total tau lan analisis p-tau (65). Nilai ELISA digunakake kanggo ndhukung klasifikasi diagnostik subyek adhedhasar kriteria cut-off biomarker AD (66, 67). Data demografi lan diagnostik dhasar kanggo diagnosa CSF liyane (FTD, ALS, lan PD) uga dipikolehi saka Emory ADRC utawa lembaga riset afiliasi. Metadata kasus ringkesan kanggo kasus Emory CSF iki bisa ditemokake ing Tabel S1A. Karakteristik replikasi Swiss CSF 3 kohort wis diterbitake sadurunge (45).
CSF nemokake sampel. Kanggo nambah kedalaman panemuan set data CSF, konsumsi kekebalan protein sing akeh banget ditindakake sadurunge trypsinization. Singkatnya, 130 μl CSF saka 40 sampel CSF individu lan volume sing padha (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) diselehake ing kolom spin (Thermo Fisher Scientific, A89868) ing kamar. suhu Inkubasi). Sawise muter 15 menit, centrifuge sampel ing 1000g kanggo 2 menit. Piranti panyaring ultracentrifugal 3K (Millipore, UFC500396) digunakake kanggo konsentrasi sampel efluen kanthi sentrifugasi ing 14.000g suwene 30 menit. Encer kabeh volume sampel nganti 75 μl nganggo saline buffer fosfat. Konsentrasi protein dievaluasi kanthi cara asam bicinchoninic (BCA) miturut protokol pabrikan (Thermo Fisher Scientific). CSF immunodepleted (60 μl) saka kabeh 40 sampel dicerna nganggo lysyl endopeptidase (LysC) lan trypsin. Ing cendhak, sampel iki suda lan alkylated karo 1,2 μl 0,5 M tris-2 (-carboxyethyl) -phosphine lan 3 μl 0,8 M chloroacetamide ing 90 ° C kanggo 10 menit, lan banjur sonicated ing adus banyu kanggo 15 menit. Sampel diencerake nganggo buffer urea 193 μl 8 M [8 M urea lan 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] nganti konsentrasi pungkasan 6 M urea. LysC (4,5 μg; Wako) digunakake kanggo pencernaan sewengi ing suhu kamar. Sampel kasebut banjur diencerake dadi 1 M urea kanthi 50 mM amonium bikarbonat (ABC) (68). Tambah jumlah sing padha (4,5 μg) saka trypsin (Promega), banjur inkubasi sampel kanggo 12 jam. Asamake larutan peptida sing dicerna dadi konsentrasi akhir asam format (FA) 1% lan asam trifluoroasetat (TFA) 0,1% (66), banjur diresiki nganggo kolom Sep-Pak C18 50 mg (Waters) kaya sing kasebut ing ndhuwur (25) . Peptida kasebut banjur diencerake ing 1 ml asetonitril 50% (ACN). Kanggo standarisasi kuantifikasi protein ing batch (25), 100 μl aliquot saka kabeh 40 conto CSF digabungake kanggo ngasilake sampel campuran, sing banjur dipérang dadi limang sampel standar internal global (GIS) (48). Kabeh conto individu lan standar gabungan dikeringake kanthi vakum kacepetan dhuwur (Labconco).
CSF nyalin sampel. Dayon lan rekan-rekan sadurunge wis njlèntrèhaké panipisan kekebalan lan pencernaan sampel salinan 3 CSF (45, 46). Sampel replika sing isih ana ora immunodepleted individu. Digest conto unremoved iki ing trypsin minangka diterangake sadurunge (17). Kanggo saben analisis bola-bali, 120 μl aliquots saka peptida eluted saka saben sampel padha pooled bebarengan lan dipérang dadi aliquots volume witjaksono kanggo digunakake minangka standar internal global TMT-labeled (48). Kabeh conto individu lan standar gabungan dikeringake kanthi vakum kacepetan dhuwur (Labconco). Kanggo nambah sinyal protein CSF sing kurang akeh, kanthi nggabungake 125 μl saka saben sampel, sampel "ditingkatake" disiapake kanggo saben analisis replikasi [ie, sampel biologi sing niru sampel riset, nanging jumlah sing kasedhiya yaiku luwih gedhe (37, 69)] digabung dadi sampel CSF campuran (17). Sampel campuran banjur immunoremoved nggunakake 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Resin Removal (Thermo Fisher Scientific, A36372), dicerna kaya sing kasebut ing ndhuwur, lan kalebu ing pirang-pirang label TMT sabanjure.
Wektu kirim: Aug-27-2021